2013 Fiscal Year Research-status Report
ヒストンH3ジメチル化におけるE3リガーゼRNF168のアダプターとしての役割
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25550028
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中田 慎一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70548528)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | RNF168 / 53BP1 |
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| Research Abstract |
FlagタグのついたRNF168をU2OS細胞に発現させ、Flag抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をウエスタンブロット法により解析し、RNF168とBAT3およびDOT1Lが蛋白複合体を形成していることを確認した。
BAT3もしくはDOT1LをsiRNAによりノックダウンした細胞にneocarzinostatinを用いてDNA2本鎖損傷を発生させ、53BP1および細胞周期マーカーのCENPFの免疫染色を行った。その結果、CENPF陰性の細胞においてはBAT3およびDOT1Lのノックダウンにより53BP1はDNA損傷部位に集積しにくくなることを確認した。
BAT3およびDOT1LのノックダウンではDNA損傷応答にかかわる分子の発現量が低下することは無いことも確認し、53BP1のDNA損傷部位への局在低下がBAT3やDOT1Lの発現抑制により起きたことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画通り、RNF168-BAT3-DOT1Lの結合を免疫沈降法により確認した。RNF168ノックダウン時のDOT1LとヒストンH3との結合を確認する予定であったが、この実験は、DOT1Lノックダウン時に53BP1のDNA損傷部位への局在が抑制されるという条件が確認されてこそ意義があるものと考えられるため、実験の順番を入れ替えて行った。そのため、RNF168ノックダウン時のDOT1LとヒストンH3との結合を確認する実験結果を得られなかったが、その代わりに26年度以降に計画していた免疫染色実験やRNF168の変異体発現プラスミドの作成を行ったため、総合的には順調に研究が進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNF168ノックダウンによるヒストンH3 K79のジメチル化の変化、RNF168ノックダウン細胞におけるDOT1LとヒストンH3との結合、ヒストンH3 K79のジメチル化の変化にRNF168のユビキチン結合ドメインおよびRINGドメインは必要か？などについて免疫沈降法を用いた実験により検証を行っていく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
免疫沈降による実験のうち、一部の実験については、免疫染色法を用いた実験結果を参考にして実験計画を立てる必要があると判断した。そのため、比較的費用のかかる免疫沈降実験の一部を次年度に繰り越し、一方で、費用が比較的少額ですむ免疫染色実験を繰り上げて行ったため、差額が生じた。
免疫沈降実験を行うための抗体、ビーズなどの実験消耗品を購入し、計画した実験を遂行する。
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