2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒストンH3ジメチル化におけるE3リガーゼRNF168のアダプターとしての役割
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25550028
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中田 慎一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70548528)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DNA損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
FlagタグのついたRNF168をU2OS細胞に発現させ、Flag抗体を用いて免疫沈降し、RNF168とBAT3およびDOT1Lが蛋白複合体を形成していることを確認した。この結合は、DNA損傷の有無にかかわらず確認された。また、RNF168がDNA損傷部位に局在するために必要なユビキチン結合ドメインを欠損したRNF168とこれらの分子との結合も観察された。報告者らは、RNF168のDNA損傷部位への局在に必要とされるRNF8が存在しない場合でも、過剰発現したRNF168がクロマチンにアクセスし、ヒストンをユビキチン化できることを見いだしている。これらのことを総合すると、一過性過剰発現系によって得た結果だけでは、DNA損傷応答による反応を正確に評価することができず、タグをつけたRNF168の発現をendogenousレベルまで下げ、さらに慎重な検証を進めていく必要があると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、昨年度の免疫染色による研究成果に加えて、共免疫沈降法により、RNF168とBAT3-DOTL1との結合様式を解明する予定としていた。確かに結合することは確認することができるものの、外来性のRNF168の発現が内在性のRNF168のはつげんよりもかなり多いことによりDNA損傷依存的な結合を検出することができず、DNA損傷応答研究という観点では、まだ十分な結果を得ることができていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、TET-inducible cDNA発現レンチウイルスベクターを構築し、HA-RNF168発現細胞株を樹立している。この細胞では、テトラサイクリンによりHA-RNF168の発現を誘導することができ、培養液中のテトラサイクリン濃度を減少させることで、生理的なレベルでのタンパク発現を誘導できる可能性がある。野生型のみでなく、様々な変異体の安定発現株を作製し、計画している研究を推進していく予定である。
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| Causes of Carryover |
当初、一過性発現により研究を推進できると考えていたが、実際にはもっと詳細な検証が必要だと考えるに至った。検討の結果、ウイルスベクターを用いた、薬剤誘導性RNF168発現株の樹立が必要となった。しかしながら、計画変更するには人的パワーが不足しており、ウイルスベクターの樹立といったあまり経費のかからない実験を行うにとどまったため、支出が減少した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
人的パワー不足を補うため、本年度末より技術補佐員を雇用した。平成27年度は次年度使用額を人件費に充て、早期に細胞株を樹立し、予定していた研究に予算を用いて研究を推進していく予定である。
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