ゲノム編集技術を用いた人工転写因子作成によるp21遺伝子の転写制御系の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25550029
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤原 智子 (石川 智子) 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70402922)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: メダカ / ゲノム編集技術 / 転写制御 / p21 / 放射線 / 損傷応答

Research Abstract

近年、人工ヌクレアーゼ（TALEN）を利用したゲノム編集技術が注目されている。人工ヌクレアーゼは、DNAに特異的に結合するドメインと、細菌のDNA切断酵素の切断ドメインを連結させたキメラタンパク質であり、このヌクレアーゼによりゲノムDNAに二重鎖切断を導入する事が可能である。この二重鎖切断は、非相同末端結合により修復された場合、高頻度に当該遺伝子に突然変異が導入される為、新たな遺伝子ノックアウト手法として用いられている。本申請では、このキメラタンパク質のヌクレアーゼドメインを転写制御ドメインに置き換えた人工転写因子を作成し、特定遺伝子の転写オン・オフを制御できる系をメダカにおいて確立する事を目指す。本技術の標的遺伝子としてp21遺伝子をとりあげ、個体レベルでの損傷応答シグナル経路解析の優れたモデル系の構築につながる事を期待している。
そこでまず、人工転写制御因子作成に先立ち特定遺伝子に対するTALENを構築し、うまく変異が導入することができるかを確認した。数種類の遺伝子に対してTALENを構築し、構築したコンストラクトからRNAを合成してメダカ初期胚にマイクロインジェクションした。その結果、どのTALENも多少の効率の差はあるが、効率よく変異を導入できることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

効率よく特定領域に損傷導入できるTALENを構築できたことから、人工転写制御因子の作成に進むことができた。
作成したTALENによる変異個体作成を通じて、メダカ初期胚でのマイクロインジェクションを効率よく行うことができるようになった。
以上のことを総合して、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

本年度の結果を踏まえ、人工転写制御因子を組み込んだTGメダカ作成用のコンストラクトの作成を開始する。出来次第メダカ初期胚へのマイクロインジェクションを行う。TGラインが樹立でき次第TG個体での損傷応答解析を開始する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度はTGメダカの樹立まで進むことができなかったため、メダカ飼育のために必要な資材の購入を次年度に先送りしたため。
次年度予算と合わせ、人工転写制御因子作成およびメダカ飼育のための資材の購入を行う。

Research Products

• [Journal Article] The Cryptochrome/Photolyase Family in aquatic organisms. (2014)
  • Author(s): Oliveri P, Fortunato AE, Petrone L, Ishikawa-Fujiwara T, Kobayashi Y, Todo T, Antonova O, Arboleda E, Zantke J, Tessmar-Raible K, Falciatore A.
  • Journal Title: Mar Genomics Volume: 14 Pages: 14-23
  • DOI: doi: 10.1016/j.margen.2014.02.001.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Human papillomavirus and p53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma among Japanese population. (2014)
  • Author(s): Maruyama H, Yasui T, Ishikawa-Fujiwara T, Morii E, Yamamoto Y, Yoshii T, Takenaka Y, Nakahara S, Todo T, Hongyo T, Inohara H.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 無 Pages: 無
  • DOI: 10.1111/cas.12369.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] p53-Dependent suppression of genome instability in germ cells. (2014)
  • Author(s): Otozai S, Ishikawa-Fujiwara T, Oda S, Kamei Y, Ryo H, Sato A, Nomura T, Mitani H, Tsujimura T, Inohara H, Todo T.
  • Journal Title: Mutation Research Volume: 760 Pages: 24-32
  • DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2013.12.004.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Circadian and circalunar clock interactions in a marine annelid. (2013)
  • Author(s): Zantke J, Ishikawa-Fujiwara T, Arboleda E, Lohs C, Schipany K, Hallay N, Straw AD, Todo T, Tessmar-Raible K.
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 5 Pages: 99-113
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2013.08.031.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATF6α/β-mediated adjustment of ER chaperone levels is essential for development of the notochord in medaka fish. (2013)
  • Author(s): Ishikawa T, Okada T, Ishikawa-Fujiwara T, Todo T, Kamei Y, Shigenobu S, Tanaka M, Saito TL, Yoshimura J, Morishita S, Toyoda A, Sakaki Y, Taniguchi Y, Takeda S, Mori K.
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 24 Pages: 1387-1395
  • DOI: 10.1091/mbc.E12-11-0830
  • Peer Reviewed
• [Presentation] メダカにおける人工ヌクレアーゼ（TALEN）を用いた損傷乗り越えポリメラーゼ変異体の作製 (2013)
  • Author(s): 藤川芳宏、藤原（石川）智子、佐久間哲史、山本卓、藤堂剛
  • Organizer: 日本環境変異原学会第42回大会
  • Place of Presentation: 岡山市
  • Year and Date: 20131129-20131130
• [Presentation] Targeted Inactivation of Rev1 gene (2013)
  • Author(s): Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Kumi Nakamura, Yoshihiro Fujikawa, Takeshi Todo
  • Organizer: The 6th Asia and Oceania Conference on Photobiology
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 20131110-20131113
• [Presentation] The molecular structure and damaged-DNA repair activity affected by the chromophore binding states in Cryptochrome-DASH from Platynereis dumerili (2013)
  • Author(s): Kazunori Zikihara, Kohei Kasakawa, Tomoko Ishikawa, Kristin Tessmar-Raible, Satoru Tokutomi, Takeshi Todo
  • Organizer: The 6th Asia and Oceania Conference on Photobiology
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 20131110-20131113
• [Presentation] Targeted Inactivation of DNA photolyase family genes using CRISPR system (2013)
  • Author(s): Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Kumi Nakamura, Yoshihiro Fujikawa, Takeshi Todo
  • Organizer: The 6th Asia and Oceania Conference on Photobiology
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 20131110-20131113
• [Presentation] DNA-PK 自己リン酸化異常時におけるp53のDSB 修復経路選択への関わり (2013)
  • Author(s): 大西 壽子、漆原 佑介、藤原 智子、尾田 正二、藤堂 剛、三谷 啓志
  • Organizer: 日本放射線影響学会第56回大会
  • Place of Presentation: 青森市
  • Year and Date: 20131018-20131020
• [Presentation] ゲノム編集技術（CRISPR）を利用したメダカ光回復酵素遺伝子変異体の作製 (2013)
  • Author(s): 藤原(石川) 智子、藤川 芳宏、中村 公美、藤堂 剛
  • Organizer: 日本放射線影響学会第56回大会
  • Place of Presentation: 青森市
  • Year and Date: 20131018-20131020
• [Presentation] ゲノム編集技術（TALEN）を用いたメダカにおけるTLS ポリメラーゼ変異体の網羅的作製 (2013)
  • Author(s): 藤川 芳宏、藤原（石川） 智子、中村 公美、佐久間 哲史、山本 卓、藤堂 剛
  • Organizer: 日本放射線影響学会第56回大会
  • Place of Presentation: 青森市
  • Year and Date: 20131018-20131020
• [Presentation] ゲノム編集技術TALEN を用いた特異的欠損部位変異の作製方法の樹立；メダカRev1 BRCT ドメイン欠損変異体作製 (2013)
  • Author(s): 中村 公美、藤原（石川） 智子、佐久間 哲史、山本 卓、藤堂 剛
  • Organizer: 日本放射線影響学会第56回大会
  • Place of Presentation: 青森市
  • Year and Date: 20131018-20131020
• [Presentation] Genome editing in medaka: targeted inactivation of TLS polymerase genes usingTALENs (2013)
  • Author(s): Yoshihiro Fujikawa, Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Kumi Nakamura, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Takeshi Todo
  • Organizer: 18th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 20130920-20130921
• [Presentation] ATF6α/β-mediated adjustment of ER chaperone levels is essential for development of the notochord in medaka fish (2013)
  • Author(s): Tokiro Ishikawa, Tetsuya Okada, Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Takeshi Todo, Yasuhiro Kamei, Shuji Shigenobu, Minoru Tanaka, Taro L. Saito, Jun Yoshimura, Shinichi Morishita, Atsushi Toyoda, Yoshiyuki Sakaki, Yoshihito Taniguchi, Shunichi Takeda, Kazutoshi Mori
  • Organizer: 18th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 20130920-20130921
• [Presentation] Genome editing in medaka: targeted inactivation of DNA photolyase family genes using CRISPR system (2013)
  • Author(s): Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Yoshihiro Fujikawa, Kumi Nakamura, Takeshi Todo
  • Organizer: 18th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 20130920-20130921
• [Presentation] Genome editing in medaka: targeted inactivation of Rev1 gene by TALEN (2013)
  • Author(s): Kumi Nakamura, Yoshihiro Fujikawa, Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Takeshi Todo
  • Organizer: 18th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 20130920-20130921