微生物間代謝ネットワークを考慮した新しい生分解性評価の試み

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25550051
• Research Institution: Yokohama National University
• Principal Investigator: 亀屋 隆志 横浜国立大学, 環境情報研究科(研究院), 准教授 (70262467)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 代謝解析 / GC/MS / LC/MS/MS

Outline of Annual Research Achievements

前年度には、GC/MS、GC/MS/MS、LC/MS/MSを用いた代謝解析技術の確立を行った。また、分析対象とする物質として、神奈川県における環境モニタリングデータから、環境中において検出される8物質（アジピン酸ジエチルヘキシル（DEHA）、ビスフェノールA、コレステロール、クロロベンゼン（3異性体）、フェノール、アニリン、カフェイン）を評価対象として選定した。本年度はその8物質の中で分析に必要となる同位体が十分量確保できたアニリンを対象とし、RNA-SIP法により分解に関与する微生物の特定を行った。
実験室で培養した活性汚泥30 mg/Lに対して13C-アニリン100 mg/Lを添加し、分解試験を行った。分解開始後14日目にアニリンは88％（BOD）分解されており、同時に行った12C-アニリン（分解率83%）と同程度であることを確認した。分解試験終了後、活性汚泥試料を回収し、RNAを抽出し、密度勾配遠心分離により分解に関与した微生物由来のRNA（13C-RNA）を含むフラクションを回収することとした。密度勾配遠心分離により、回収したフラクションの内、密度1.75から1.83 g/mLにおいて直線的に変化する11フラクションを微生物解析の対象とした。次に、各フラクションに含まれる16S rRNAを把握するため、16SrRNAを対象としたリアルタイムPCRを行った。いずれのフラクションにおいても16S rRNAが検出され、アニリン分解に関与しない微生物の12C-RNAと分解に関与した微生物の13C-RNAのピークの明確な分離は確認できず、微生物種毎の塩基配列を由来とする密度等の影響によりフラクション全体に分散していることが予想された。そこで、11のフラクション全てを対象として次世代シークエンスによる微生物群集構造解析を行い、アニリン分解に関与する微生物群の特定を行った。