2013 Fiscal Year Research-status Report
ポリ塩化ビフェニルの代謝効率向上を目指したP450酵素変異体の創製と局在性改変
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25550064
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
乾 秀之 神戸大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (90314509)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 水質汚濁・土壌汚染防止・ 浄化 |
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| Research Abstract |
（１）CB118を代謝するP450分子種の同定と代謝物の構造決定
土壌、底質、生物を広く汚染しているポリ塩化ビフェニル（PCB）の一種CB118（2,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl）はラットCYP1A1により２種の水酸化代謝物4-hydroxy-2,3,3',4',5-pentachlorobiphenylと5-hydroxy-2,3',4,4'-tetrachlorobiphenylに、ラットCYP2B1により3-hydroxy-2,3',4,4',5-pentachlorobiphenylに、ヒトCYP2B6により3-hydroxy-2,3',4,4',5-pentachlorobiphenylと5-hydroxy-2,3',4,4'-tetrachlorobiphenylに代謝された。代謝活性はラットCYP2B1、ラットCYP1A1、ヒトCYP2B6の順に高くなった。
（２）P450分子種のホモロジーモデリングとPCBとのドッキングモデルの構築
ラットCYP1A1、ラットCYP2B1並びにヒトCYP2B6の３次元構造を分子モデリングにより構築し、これらとCB118とのドッキングモデルを構築した。P450の活性中心であるヘム鉄と基質結合ポケットに結合したCB118との距離を推測したところ、代謝可能な5Å以内に配座するCB118はヒトCYP2B6にのみ見られた。これがヒトCYP2B6においてラットCYP2B1より代謝活性が高かった理由と考えられる。さらに、ラットCYP1A1は主に４位を水酸化したのに対し、ラットとヒトのCYP2Bサブファミリーは３位を水酸化した。これはCYP2Bサブファミリーの基質結合ポケットの極性が分極しているため、疎水性のCB118の３位炭素がヘム鉄に近づき、３位水酸化代謝物に代謝されたと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
（１）CB118を代謝するP450分子種の同定と代謝物の構造決定
CB118のP450による代謝について、ラットとヒトの間で代謝活性の違いが存在することを明らかにした。このことから実験動物を用いたPCBの毒性評価試験結果のヒトへの外挿について、十分に注意を払うべきであることが示唆された。
（２）P450分子種のホモロジーモデリングとPCBとのドッキングモデルの構築
P450によるPCBの代謝において見られるP450が由来する動物種の差、P450分子種どうしの差は、P450の基質結合ポケットへのPCBのドッキングの仕方（安定性、ヘム鉄への近づきやすさ、基質結合ポケットの極性）に由来することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
（３）P450変異体の作製とPCB代謝試験
ラット並びにヒトCYP1A1について、PCB同族体とのドッキングモデルを構築することにより、CB126並びにCB77の代謝に重要なアミノ酸をすでに決定している。これらアミノ酸はP450の基質結合ポケットの形状・性質を変化させることにより、PCBのヘム鉄への近づきやすさ、基質結合ポケットにおける安定性の向上に寄与すると考えられる。これらアミノ酸を変異させた変異体を構築し、酵母に導入し、組換え酵素を用いてその代謝活性を測定する。
（４）P450の細胞内局在性の改変
哺乳類のP450は通常細胞内において小胞体膜上に存在している。しかし、基質となるPCBは極めて脂溶性が高いため、細胞膜にとどまり細胞質や小胞体膜に移動する量は限られている。そこで、P450をPCBが濃縮する細胞膜に局在させるため、細胞膜局在性シグナルMGCTVSTQTを、P450のN末端に存在する小胞体局在シグナルと置換する。さらに緑色蛍光タンパク質（GFP）を融合し、酵母に導入する。蛍光顕微鏡下での組換え酵母におけるGFP局在の観察、細胞膜の分画により、付加したシグナル配列が機能しているか確認する。細胞膜へのP450の局在が確認された組換え酵母を用いて、PCBの代謝実験を行い、代謝効率が向上したか検討する。
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Research Products
(5 results)
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[Presentation] Amino acid variations in mammalian cytochrome P450 monooxygenases responsible for decrease of dioxin-like toxicity of polychlorinated biphenyls2013
Author(s)
Hideyuki Inui, Kiyoshi Yamazaki, Miku Yabu, Toshimasa Itoh, Keiko Yamamoto, Motoharu Suzuki, Yuuki Haga, Shintarou Mise, Masahiro Tsurukawa, Chisato Matsumura, Takeshi Nakano, Toshiyuki Sakaki
Organizer
33nd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants
Place of Presentation
Daegu, Korea
Year and Date
20130828-20130829
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