2013 Fiscal Year Research-status Report
力学刺激による血管内皮細胞内ROCK2タンパク質の移動解析
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25560203
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
工藤 奨 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70306926)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 内皮細胞 / メカノバイオロジー |
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| Research Abstract |
血流による摩擦力であるせん断応力や，血管の伸展に伴う引っ張り応力などの力学的な刺激を常に受けている血管内皮細胞の移動メカニズムを明らかにすることを目的としている．具体的には，引っ張り応力などが内皮細胞に加わった際，細胞内Rho-kinaseのROCK２（ロック２）が力学状態により偏りをもって移動することを仮定し，ROCK２をフォトクロミック蛍光タンパク質と融合させ，ROCK２の移動と細胞の移動を同時計測する．
ROCK２はその活性状態により細胞内から細胞膜へと移動することが知られている．しかしながら，その移動形態は各種阻害剤等を使用した薬品処理後の細胞を，細胞質や細胞膜に分離しウェスタンブロットなどによる解析によりその移動が確かめられてきた．本来，動的過程を観察するためには生細胞の状態でROCK２を可視化する必要がある．そのため，本研究では蛍光タンパク質を用いてROCK２を可視化する予定でいる．仮にROCK２とGFPに代表される通常の蛍光タンパク質を融合させたタンパク質を細胞内に発現させたとしても，細胞内のROCK２全体が光ってしまいその移動を追跡することは難しい．申請者の研究室では，細胞膜表面のタンパク質や細胞内のタンパク質を光転換型蛍光タンパク質Dronpaを使用して標的のタンパク質だけを可視化することでその移動を可視化し，タンパク質の移動状態を解析し成果をあげてきた実績がある．
本研究においてもこの光転換型蛍光タンパク質Dronpaを使用して可視化する予定であったが，DronpaとROCK2の融合タンパク質の作製が現時点では非常に困難となっているため，
現在ROCK2を活性化する上流タンパク質の可視化を試みている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現時点ではROCK2と光転換型タンパク質Dronpaの融合タンパク質の可視化ができていない．
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点ではROCK2と光転換型タンパク質Dronpaの融合タンパク質の可視化ができていない．そのため，引き続き融合タンパク質の作製可視化に取り組む．同時に，ROCK2の上流に存在するタンパク質の可視化にもとりくみ，間接的ではあるがROCK２の動態をとらえる予定である．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は，初年度であり調査が主であったため．
ROCK2の間接的な可視化法をあらたに作製し，当初予定した計画の範囲を広げ研究を進める．
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