2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25560419
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
井本 正哉 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (60213253)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ホヤ / 脊索管形成 / 化学発生学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① GST14-3-3アイソフォームを用いてホヤ破砕抽出液から結合タンパク質を探索したが，GST14-3-3 分解物のバンドが多すぎる故なのかあらゆる条件において見出すことができなかった．そこでHis-14-3-3 をクローニングして精製し同様のプルダウンアッセイを行ったところ，1つの14-3-3 結合タンパク質を見出し,さらに架橋剤であるDSPやDTMEを用いることで2つの14-3-3 結合タンパク質を見出し，これらをTOF-Mass で同定した．
② 当初はモルフォリノを用いることを予定していたが，2014年にCRISPR/Cas 9 を用いたノックアウト法が登場したためこちらを用いることにした．上記①で見出した3つのsgRNA ベクターを作成しノックアウトの準備は整ったが，脊索管形成の評価はまだできていない．
③ 上記①で見出した14―3―3結合タンパク質の抗体を購入したがいずれもホヤの抽出液において想定分子量のところにバンドを見出さなかったため，14-3-3との相互作用がUTKO1によって阻害されるかは確認が取れていない．また14-3-3アイソフォーム特異的抗体は作製が完了したが，14―3―3結合タンパク質は抗体がないため，両者の局在は評価できていない．したがって抗体の作製を外部に依頼するか, 14―3―3結合タンパク質とGFPを融合したコンストラクトをホヤ体内で発現させることで局在を評価することを計画している．
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