造血幹細胞発生機構解明のためのマイクロデバイスの開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25600065
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Japan Women's University
• Principal Investigator: 佐藤 香枝 日本女子大学, 理学部, 准教授 (40373310)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: マイクロナノバイオシステム / 造血幹細胞

Research Abstract

すべての血液細胞の源となる造血幹細胞は、マウスでは胎生10.5日目ごろより背側大動脈腹側血管腔から発生する。近年、ゼブラフィッシュなどを使った実験により血流による物理刺激が造血幹細胞発生を促すことが示唆され注目を集めている。この機構を解明するには、マイクロ流体デバイスを用いる実験系が最適であると着想した。本研究では、マイクロ流体デバイス内の微細流路に弾性率の異なるゲルをコート後、背側大動脈に相当する細胞を培養し、送液培養で細胞にシアストレスを与えることで、胎生期の背側大動脈における造血幹細胞発生部位を模擬した実験系を作り、造血幹細胞の発生へのシアストレスの影響を明らかにすることを目的とする。
今年度は、in vitro分化誘導したES細胞（中胚葉前駆細胞）から調整した血管内皮細胞集団から造血幹細胞は発生する。この現象はどれだけの母集団があれば発生するのかわかっていない。そこで、現在の実験系より小さい数 mmのチャンバーを作成し、その中に一定量のES細胞を培養し造血幹細胞の発生を調べた。直径35 mmの細胞培養用ディッシュと直径5 mmの孔を持つPDMSシートを貼り付けたカバーガラスを用いて、OP9ストロマ細胞と中胚葉前駆細胞の共培養を行った。ES細胞をflk1+・ckit+で処理した中胚葉前駆細胞をそれぞれ2080個/cm2、4160個/cm2になるように添加した。35 mmの培養皿ではどちらの添加数でも血液細胞のコロニーが出現したが、5 mmのウェルでは4160個/cm2の場合のみ血液細胞のコロニーが出現した。現在引き続き再現性を確認中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究項目は、以下の3つを挙げており、そのうち1および2を達成できたため、おおむね目標を順調に達成できていると考えている。
1.　マイクロウェル、マイクロ流路中でのOP9細胞の培養法の確立
2.　マイクロウェル中での造血幹細胞の発生の観察
3.　マイクロ流路中での造血幹細胞の発生の観察

Strategy for Future Research Activity

1.　引き続き通常の実験系より小さい数 mmのチャンバーを作成し、その中に一定量のES細胞を培養し、ES細胞数、または培養面積に依存した造血幹細胞の発生を調べる。細胞培養基板の弾性率が細胞分化に影響を与えることが知られているので、ガラス基板の上にハイドロゲルをコートした系も検討する。シアストレスのない状態での発生確率を調べたのちに、マイクロ流体デバイス内での培養に移行する。2.　マイクロデバイス内でマウス胚の血流測である 5 dyn/cm2付近で培地を流しながら培養し、シアストレスと一定量のES細胞から発生する造血幹細胞の数の関係を調べる。これらの結果より、造血幹細胞の発生へのシアストレスの影響を明らかにする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究項目2であるマイクロウェル中での造血幹細胞の発生の観察 は、複数回行う予定であったが、OP9細胞の維持がうまく行かずに1度しか行うことができなかった。そのための経費が差額として生じている。
OP9細胞の維持はできるようになったため、今年度は複数回マイクロウェル中での造血幹細胞の発生の観察を追加して行う予定である。