2014 Fiscal Year Annual Research Report
10BASEd-T法による疾患蛋白質分解触媒の開発
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25620127
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| Research Institution | The University of Electro-Communications |
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Principal Investigator |
瀧 真清 電気通信大学, 情報理工学(系)研究科, 准教授 (70362952)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 10BASEd-T / ファージディスプレイ / ファーマコフォア / サリチル酸 / ライブラリー / 人工分子進化 / T7ファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① 触媒中心の人工分子コア（サリチル酸）が蛋白質切断触媒能を殆ど持たなかった前年度の問題について、2価金属イオンをルイス酸触媒として利用する方針に切り替え実験を行った。具体的には、2価金属イオンと配位結合する可能性を持ち電子状態の異なる有機配位化合物を、パラレル合成法にて網羅的に合成・精製してNMRおよびLC-MS測定などを行うことで同定した。これらの化合物と金属イオンとを混合して配位結合させたのち、モデル蛋白質であるウシ血清アルブミン（BSA）に対して作用させ、各々の蛋白質切断能を確かめた。生理的条件下で37℃・一晩インキュベーションを行ったのち、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）にて確認を行ったところ、幾つかの金属錯体の存在下でBSAの断片化が見られた。② 上記人工分子コア周辺のランダムペプチド部分が短すぎて反応場を形成しない問題について、適切な反応場を形成しうる3D構造を持つランダムペプチドライブラリーの再作製を行った。具体的には、予め3D構造を持つことが分かっているペプチドライブラリーをコードするDNAを作製し、遺伝子工学的な手法にて、市販のT7Select10ベクター内のマルチクローニングサイト内に挿入することでライブラリーを作製し、これらをT7バクテリオファージ内にパッケージングした。SDS-PAGEおよびプラーク形成実験などから、本ペプチドがファージ上にて適切に提示されていること、および、本ペプチドライブラリーは107以上の多様性を持つことを確認した。10BASEd-T反応を利用して同ライブラリーペプチドに対し人工分子コアを共有結合可能なこと、および、ペプチドライブラリーに用いているスカフォールドが特有の3D構造を持っていることも、予備的に確認を行っている。
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