2014 Fiscal Year Research-status Report
病原性細菌による水環境汚染の実態解明に資する病原性細菌の網羅的定量解析手法の開発
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25630226
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
井上 大介 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (70448091)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清 和成 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (80324177)
岩下 正人 北里大学, 医療衛生学部, 助教 (00137895)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 病原性細菌 / 水環境 / 網羅的定量解析 / DNAマイクロアレイ法 / DNAインターカレーター処理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、900余の病原性細菌（生菌）を一度に定量解析する新規解析手法を開発し、同手法を活用して水環境中の病原性細菌汚染の実態を解明することを目標として、①DNAインターカレーター処理を用いた水中の生菌DNA選択検出報の開発、②DNAマイクロアレイを用いた900種余の病原性細菌の一斉定量解析法の開発、③国内外の水環境中における病原性細菌汚染のデータ基盤の整備の3つの研究課題の達成を目指している。
平成26年度は、平成25年度から実施している課題①および課題②を継続するとともに、課題③に関して国内河川におけるモニタリング調査を実施した。
課題①については、平成25年度にも使用した標準菌のうち、Pseudomonas putida、Enterococcus faecalis、Rhodococcus equiを用い、環境水試料に対するDNAインターカレーター処理（エチジウムモノアザイド、プロピジウムモノアザイドによる処理）の適用方法について検討を進めた。
課題②については、新たなDNAマイクロアレイフォーマットを完成させるとともに、バクテリアゲノム情報の調査によって標的細菌の16S rRNA遺伝子のコピー数をある程度明らかにした。また、DNAマイクロアレイ解析の条件について検討し、最適化を行った。
課題③については、夏季、秋季、冬季に相模川水系におけるモニタリング調査を実施し、各種水質分析を行った。また、一部の試料を対象として、DNAインターカレーター処理の有無による病原性細菌解析結果の差異を調査し、河川水中の病原性細菌の存在状態について知見を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
課題①『DNAインターカレーター処理を用いた水中の生菌DNA選択的検出法の開発』については、これまでに使用していた方法では、一部の細菌において生菌の検出阻害が生じることが明らかになり、DNA抽出方法を含めて、適用方法についてさらなる検討が必要であることが明らかになった。
課題②『DNAマイクロアレイを用いた900種余の病原性細菌の一斉定量解析法の開発』については、GenBankに登録されているバクテリアゲノム情報から16S rRNA遺伝子のコピー数を整理しているが、情報が大量であるため、想定していたよりも時間を要している。
課題③『国内外の水環境における病原性細菌汚染のデータ基盤の整備』は、概ね予定していた内容を達成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題①『DNAインターカレーター処理を用いた水中の生菌DNA選択的検出法の開発』：生菌の検出阻害が生じず、かつ、死菌を選択的に検出できるよう、DNAインターカレーター処理の環境水試料への適用方法を明らかにし、手法を完成させる。
課題②『DNAマイクロアレイを用いた900種余の病原性細菌の一斉定量解析法の開発』：標的病原性細菌の16S rRNA遺伝子コピー数を整理し、DNAマイクロアレイ解析結果に基づいて病原性細菌数を評価する方法論を確立する。
課題③『国内外の水環境における病原性細菌汚染のデータ基盤の整備』：国内外におけるモニタリング調査を実施する。国内は、平成26年度に調査を行った相模川水系において調査を継続するとともに、他の特徴的な河川（畜産業等の排水が流入する河川や汚染度の高い河川）での調査も実施することを検討している。また、国外（アジア地域）でのモニタリング調査も実施し、病原性細菌汚染の実態について広くデータを蓄積し、水質分析結果と併せて整理する。
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| Causes of Carryover |
課題②『DNAマイクロアレイを用いた900余の病原性細菌の一斉定量解析法の開発』において、文献調査と実験的検討による標的病原性細菌の16S rENA遺伝子コピー数の調査を予定していたが、当初想定していたよりも多くの細菌種のドラフトゲノムデータが公表されており、実験的にコピー数を明らかにする必要がないことが明らかになった。このため、当該年度の所要額と実支出額に差異が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度の研究では、平成25、26年度に達成できなかったDNAインターカレーター処理の環境水試料への適用方法に関する検討を継続して行う予定をしている。また、国内のモニタリング調査では、注視すべき病原性細菌の体系化に向け、当初予定していた相模川水系だけでなく、他の河川でも調査を進めることを予定している。これらの検討に使用する試薬・器具類等の購入に余剰額を充てることにより、平成27年度の請求額と合わせて、予定している全ての研究内容を遅滞なく進めていく予定である。
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[Journal Article] High-throughput DNA microarray detection of pathogenic bacteria in shallow well groundwater in the Kathmandu Valley, Nepal2015
Author(s)
Daisuke Inoue, Takuji Hinoura, Noriko Suzuki, Junqin Pang, Rabin Malla, Sadhana Shrestha, Saroj Kumar Chapagain, Hiroaki Matsuzawa, Takashi Nakamura, Yasuhiro Tanaka, Michihiko Ike, Kei Nishida, Kazunari Sei
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Journal Title
Current Microbiology
Volume: 70
Pages: 43-50
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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