2013 Fiscal Year Research-status Report
顆粒結合タンパク質を利用した微生物の共重合ポリエステル生合成能の向上と制御
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25630373
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
福居 俊昭 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (80271542)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / 微生物工学 / 生分解性プラスチック / バイオプラスチック |
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| Research Abstract |
本研究では、環境低負荷型プラスチックとして期待されるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の微生物合成において、PHA合成酵素PhaCとPHA顆粒結合タンパク質PhaPに着目した新たな生合成制御の確立を目的としている。申請段階で、ポリ(3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸）[P(3HB-co-3HHx)]生産菌においてPhaPをPhaCと同一微生物種由来とすることで共重合組成が変化する現象を見出していたが、その変化の程度は大きくはなかった。本年度ではまず宿主とする菌株の検討を行い、細胞内でのモノマー供給が十分な株を宿主としてPhaCとPhaPを同一微生物種由来とする各種組換え株とそれらのコントロール株を多数作製した。これらの株を用いて植物油を炭素源としたP(3HB-co-3HHx)生合成を行ったところ、PhaPとPhaCの由来を同じとすることで、すでに高いPHA蓄積率がさらにやや増加し、かつ3HHx分率が大きく増加することを見出した。加えて、株によっては生成したPHAの分子量も有意に変化していた。これらのことから、PHA顆粒表面におけるPhaCとPhaPの相互作用によってPHA生合成を制御できることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PhaPをPhaCと同じ微生物種由来とすることによる共重合PHA生合成への効果が当初は小さかった理由として、宿主であるR. eutrophaが本来有するPhaPパラログの影響を考えていたが、本年度の検討で、当初株では共重合PHA生合成におけるモノマー供給が不足していたためであり、モノマー供給が強化された株ではPhaP置換による大きな効果があることを見出した。また、このPhaPの置換による効果は共重合組成だけではなく、分子量にも影響することを示し、PhaC-PhaP相互作用によるPhaCの重合特性の変化がより強く示唆された。これまでのP(3HB-co-3HHx)生合成の研究では3HHx分率増加はPHA生産量の低下を伴うことが多く見られたが、本研究におけるPhaP置換ではPHA生産量がやや増加しつつ3HHx分率が増加したことから、共重合PHAの微生物生産の観点からも重要である。これらのことから、概ね順調に進展していると考えている。一方で、PHA顆粒の解析、PhaC-PhaP相互作用の解析やPhaC重合特性の解析などには到らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度で作製したPhaP置換株およびコントロール株から密度勾配遠心によりPHA顆粒を単離する。その単離顆粒の表面に結合したPHAシンターゼについて鎖長の異なる基質に対する動力学的解析を行うことで、基質特異性や触媒特性の違いを評価する。また単離したPHA顆粒の電気泳動、あるいはPhaCおよびPhaPの特異的抗体を用いた検出により表面におけるPhaCとPhaPの存在量を求め、動力学的パラメーターとの相関を検討する。さらに作製した組換え株について菌体内PHA顆粒の形状、大きさ、数を透過型電子顕微鏡により観察し、PhaP置換が菌体内でのPHA重合におよぼす影響を調べる。また、PhaP-PhaC相互作用のより直接的な検出として、表面プラズモン共鳴法などによるin vitro系や細菌two-hybrid法などによるin vivo系での解析を検討する。
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