2013 Fiscal Year Research-status Report
GPCR立体構造特異的モノクローナル抗体の革新的作製技術の創製とその応用
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25630376
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
冨田 昌弘 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20183494)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湊元 幹太 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (80362359)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / 生体分子 / 生体機能利用 / 免疫学 / 細胞・組織 |
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| Research Abstract |
本研究では、「抗原の高次構造特異的モノクローナル抗体」の革新的作製技術の創製を目指した。モノクローナル抗体は、目的抗原との高い特異性・親和性およびその均一性から基礎研究のみならず臨床分野でも幅広く利用されている。近年、次世代の医薬品として注目されており、世界中でその研究が展開している。しかし、現在のところ、モノクローナル抗体の大多数は、抗原タンパク質の一次構造を認識している。抗原は独自の高次構造を保持することによってその機能を発揮しているため、抗原の高次構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の利用価値は、計り知れないほど高い。しかし、未だその方法は確立されていない。本研究では、抗原発現ミエローマ細胞を用いたB細胞選択に基づく「革新的作製技術」を提案することを目的とした。
抗原が高次構造を保持したまま免疫系に認識されることを目指し、DNA免疫用発現ベクターの構築を行い、DNA免疫法を利用した。組換えプラスミドベクターを複数回マウス下腿筋に注射することによりDNA免疫化を行った。この時、電気パルスを負荷することによってDNAのマウス細胞への導入を促進した。さらに、DNA免疫の効率を高めるため、最終免疫に抗原発現CHO細胞を用いて免疫化することも検討した。抗原発現CHO細胞は、不活性化センダイウイルスを用いて組換えベクターをCHO細胞にトランスフェクションして作製した。また、DNA免疫後の感作Ｂ細胞の選択のために必要となる、抗原発現ミエローマ細胞の作製も同様な方法で同時に行った。DNA免疫化後のマウス血清中に存在する高次構造認識抗体を抗原発現CHO細胞に基づくCell-ELISA法で確認したところ、コントロールのCHO細胞と比べて有意な差で目的抗体を認めることができた。さらに、予備的ではあるが、抗原発現ミエローマ細胞による感作Ｂ細胞選択を可視化解析によって確認することができた
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
抗原が、高次構造を保持したまま免疫系に認識されることを目的とし、DNA免疫用発現ベクターの構築を行い、DNA免疫法を利用した。その際、マウス内での抗原発現量を多くするために、マウス内でのベクターの増幅を可能とするウシパピローマウイルスの1部領域をベクターに組み込む工夫を行った。組換えベクターを３週間間隔で複数回マウス下腿筋に注射することによりDNA免疫化を行った。この時、電気パルスを負荷することによってDNAのマウス細胞への導入を促進した。さらに、DNA免疫の効率を高めるため、最終免疫に抗原発現CHO細胞を用いて免疫化することも検討した。CHO細胞上に発現される抗原は、本来の立体構造を保持した状態で発現されていると考えられるため、高次構造認識感作Ｂ細胞を得るためには、有効な方法であると推測された。抗原発現CHO細胞は、不活性化センダイウイルスを用いて組換えベクターをCHO細胞にトランスフェクションして作製した。トランスフェクション効率は、目的抗原の下流に存在するレポーター遺伝子 (EGFP)の発現によって共焦点レーザー顕微鏡によって確認した。また、DNA免疫後の感作Ｂ細胞の選択のために必要となる、抗原発現ミエローマ細胞の作製も同様な方法で同時に行った。一般的にミエローマ細胞への遺伝子導入は、通常のリポフェクション法などでは効率が低いとされているが、不活性化センダイウイルスを用いることによって改善することができた。DNA免疫化後のマウス血清中に存在する高次構造認識抗体を抗原発現CHO細胞に基づくCell-ELISA法で確認したところ、コントロールのCHO細胞と比べて有意な差で目的抗体を認めることができた。さらに、予備的ではあるが、抗原発現ミエローマ細胞による感作Ｂ細胞選択を、可視化解析によって確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗原発現ミエローマ細胞によるＢ細胞選択： 抗原発現ミエローマ細胞を用いて、DNA免疫法によって感作されたＢ細胞を選択する。このステップは非常に重要であると考えられる。ミエローマ細胞上に発現される抗原は、立体構造を保持していると推測されるため、抗原発現ミエローマ細胞によって選択されるＢ細胞は、立体構造認識抗体を
特異的に産生している確率が非常に高い。その選択原理は、Ｂ細胞表面に発現される抗原レセプター（B細胞受容体）を用いて行うことができる。
Ｂ細胞－ミエローマ細胞複合体の可視化解析： 抗原抗体反応に基づき、抗原発現ミエローマ細胞によって選択された目的のＢ細胞との複合体を蛍光ラベルにて検証する。Ｂ細胞は、抗マウスIgG 抗体・蛍光標識（赤色）によって可視化し、一方、抗原発現ミエローマ細胞は、目的抗原のC末端に結合したEGFP（緑色）に基づき解析を行う。さらに、Ｂ細胞－ミエローマ細胞複合体において、抗原発現ミエローマ細胞をDNA免疫によって得られた抗血清にて選択後、抗マウスIgG 抗体・蛍光標識（赤色）にてラベルすることによって、抗原発現ミエローマ細胞（この場合、黄色を呈する）の目的抗原発現の有無も検討する。
Ｂ細胞－ミエローマ細胞複合体の選択融合： 本研究の主要項目である、目的の立体構造認識抗体産生ハイブリドーマの作製を目的として、Ｂ細胞－ミエローマ細胞複合体に対して直流矩形波電気パルスを用いて選択融合する。電気パルス融合の特徴は、架橋形成したＢ細胞－ミエローマ細胞複合体のみを選択融合し、架橋形成されてな他の細胞の融合を起こさないところにある。融合効率を大幅に促進する目的で、両細胞を架橋形成後、融合を起こさない程度の低活性センダイウイルス(HVJ)を加えることによって、両細胞の接触面積を広くした条件での選択融合も検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
試薬等、当初予定していた価格よりも安価で導入できたため、未使用額が生じた。
当初の計画通り、抗原発現ミエローマ細胞を用いて、DNA免疫法によって感作されたＢ細胞を選択する。抗原抗体反応に基づき、抗原発現ミエローマ細胞によって選択された目的のＢ細胞との複合体を蛍光ラベルにて検証する。さらに、本研究の主要項目である、目的の立体構造認識抗体産生ハイブリドーマの作製を目的として、Ｂ細胞－ミエローマ細胞複合体に対して直流矩形波電気パルスを用いて選択融合する。
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