2014 Fiscal Year Research-status Report
GPCR立体構造特異的モノクローナル抗体の革新的作製技術の創製とその応用
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25630376
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
冨田 昌弘 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20183494)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湊元 幹太 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (80362359)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / 生体分子 / 生体機能利用 / 免疫学 / 細胞・組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、モノクローナル抗体は、次世代の医薬品として注目されており、世界中でその研究が展開している。しかし、大きな問題が１つある。モノクローナル抗体の大多数は、抗原タンパク質の一次構造を認識している。そこで、本研究では、新たなハイブリドーマテクノロジーに基づく高次構造認識モノクローナル抗体の創製を目的とした。
GPCR（Gタンパク質共役受容体）の１つであり、ストレス応答に関与することが報告されているhCRHR1 (human corticotropin-releasing hormone receptor 1; 副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体 1) に着目した。hCRHR1遺伝子の下流にGFP（緑色蛍光タンパク質）遺伝子を結合した組換えプラスミドベクターを用いて、ミエローマ細胞へのトランスフェクションをHVJ（センダイウイルス）によって行った。その結果、GFPを指標としてhCRHR1発現ミエローマ細胞を確認することができた。そこで、DNA免疫法を行ったマウスから感作B細胞を含む脾細胞懸濁液を調製して、hCRHR１発現ミエローマ細胞による目的の感作B細胞選択を検討した。この原理は、感作B細胞表面の抗原レセプター（抗hCRHR1抗体）を介した抗原抗体反応を利用して、hCRHR1発現ミエローマ細胞が結合することに基づいている。B細胞をAlexa568標識抗マウスIgG抗体によって蛍光ラベルし、目的の感作B細胞（赤色）－hCRHR1発現ミエローマ細胞（緑色）複合体を可視化解析に基づき確認するのに成功した。そこで、両細胞を電気パルスによって選択融合を行った結果、多くのハイブリドーマが認められ、さらに、hCRHR1発現CHO細胞に基づくCell-ELISA法に基づき、複数のCell-ELISA陽性ハイブリドーマを確認することができた。高次構造特異的モノクローナル抗体作製の可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
大きく分けて２つの理由が考えられる。
１つは、hCRHR1発現ミエローマ細胞の効率的な作製である。一般的に免疫系の細胞へのプラスミドベクターの導入効率は低く、従来のリポフェクション法では困難とされている。本研究では、不活性化センダイウイルスを用いることによってその点を改良し、導入効率が格段に促進された。その結果、本研究において、最も重要なステップの１つである目的の感作B細胞を選択するために必要となる、hCRHR1発現ミエローマ細胞の膜上での目的抗原hCRHR1の発現が高められ、hCRHR1発現ミエローマ細胞による感作B細胞の選択効率が改善されたと考えられる。
もう１つの理由は、マウスの免疫方法にある。そのポイントは、hCRHR1遺伝子導入組換えプラスミドベクターを利用してDNA免疫を行った後、hCRHR1発現CHO細胞を用いた腹腔内免疫を行ったことである。その結果、目的の感作B細胞の免疫化効率が高められたと考えられる。DNA免疫法においては、高次構造を保持した状態でhCRHR1がマウス体内で発現され、それが免疫システムによって認識され、目的のB細胞が感作される。複数回DNA免疫を行うことによって、目的のB細胞の成熟度が促進される。本研究では、さらなる免疫方法として、立体構造を保持した状態で発現されているhCRHR1をマウス腹腔内に投与することによって、直接的に免疫系が賦活化されたと思われる。その結果、目的のB細胞の感作効率が高められ、抗原の高次構造に対して高親和性・高特異性をもつ抗体産生B細胞へと分化したと考えられる。hCRHR1発現ミエローマ細胞と感作B細胞を融合して得られる高次構造特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製において、hCRHR1発現ミエローマ細胞による感作B細胞の選択効率が高まったことが大きな進捗に繋がったと推測される。
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| Strategy for Future Research Activity |
可視化解析によって目的のB細胞－ミエローマ細胞複合体形成が明らかとなり、さらに、両細胞の電気パルス融合によってCell-ELISA陽性ハイブリドーマを得ることができた。このことは、抗原発現ミエローマ細胞を用いたB細胞選択に基づく「革新的ハイブリドーマテクノロジー」の実現性を強く支持する結果であった。そこで、今後、次の２つのポイントに的を絞り、さらに、推進する予定である。
１）IgGタイプの立体構造特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
IgMタイプのモノクローナル抗体も親和性が高い点では、非常に良い抗体であるが、５量体を形成しているため、安定性が十分でない欠点がある。そこで、IgGタイプの立体構造特異的モノクローナル抗体を選択的に作製できる方法を検討する。１つは、免疫方法のさらなる改良である。DNA免疫の回数を増やし、IgMからIgGへのクラススイッチをより促進する方向に免疫系を活性化する。さらに、予め抗マウスIgG抗体にてIgGタイプの抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングし、その後、Cell-ELISA法によって、目的の立体構造特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。
２）作製されたモノクローナル抗体の立体構造認識能の解析
この目的のためにhCRHR1を組み込んだプロテオリポソームの作製を考えている。プロテオリポソームは、目的のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスとリポソームとを酸性条件下で融合することによって、目的のタンパク質の方向性を保った状態でリポソームに組み込むことができる。そこで、hCRHR1を組み込んだ組換えバキュロウイルスを作製し、酸性条件下でリポソームとの融合を試みる。この時、より生体内の細胞に近い大きさのプロテオリポソームを構築するため、細胞サイズの巨大リポソーム (10 マイクロメートル以上) を用いることを検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度における予算の軽減による研究の遅滞を防ぐために当該使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
抗原発現ミエローマ細胞によって感作B細胞を選択し、B細胞－ミエローマ細胞複合体を形成させ、電気パルス融合によって両細胞を選択融合してGPCRに対する立体構造特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの革新的作製技術の創製を進める。さらに、プロテオリポソームを用いて目的のモノクローナル抗体の立体構造認識の検証を行う。GPCRをターゲットとした次世代抗体医薬への応用を積極的に進める。
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