in vivo 培養システム：生体内に生息する未培養細菌の獲得と解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25630383
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 青井 議輝 広島大学, サステナブル・ディベロップメント実践研究センター, 特任講師 (40386636)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金本 大成 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20260755)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 分離培養 / 難培養性微生物 / 口腔内微生物 / 共培養

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、デバイスの開発および運用方法の確立についてヒト細胞との共培養を可能にする全く新しいタイプのデバイスを開発することを新たな項目として加えた。生体内の環境、例えば口腔内は宿主の細胞や組織およびそこに生息する多様な微生物群が存在する非常に複雑な環境であるためにin vivo培養の効果や学術的意義を評価するためにはより単純化した系が必要不可欠であると判断した。ヒト細胞との共培養では培養デバイスの内側だけでなく外側も無菌状態で全ての操作を行わなければいけないため、現状のデバイスや方法とは異なり、デバイスの構造およびそれを用いた培養方法において抜本的な変更が必要となったが、これまで開発したデバイスおよび培養方法を基盤とすることで達成した。具体的には、孔径0.1マイクロメートルのアイソポアメンブレン（平膜）を用いた薄型のデバイスであり、片方の面をメンブレンで、もう一方の面をカバーガラスで蓋をした状態の円盤のような形状の培養チャンバーである。さらにメンブレン底の細胞培養用のデバイスと併用することで細胞との共培養を可能とした。微生物細胞は多数の微小ゲル粒子（GMD）をチャンバー内に封入して培養を行う。具体的には、低融点アガロースゲルを用いw/oエマルションを作成する要領で作成した微小ゲル粒子（微生物細胞が0-1つずつ封入）をアルギン酸ナトリウムゲル溶液と混合させる。その後チャンバー内に注入しアルギン酸ゲルは塩化カルシウム溶液を用いて固化させる。また、培養を行った後のGMDの回収方法，セルソータ（FACS）を用いた２次培養操作の最適な使用条件の検討，セルソーターを用いない回収方法の確立，二次培養における培養条件（培地組成など）による影響評価などを行った結果、分離培養を行うことが可能な条件を見出すことに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究全体の目標は、生体内で未培養細菌の分離培養を行う「in vivo培養」という全く新しいコンセプトに基づく分離培養戦略を創生・提案することである。生体内の環境、例えば口腔内は宿主の細胞や組織およびそこに生息する多様な微生物群が存在する非常に複雑な環境である。従ってin vivo培養の効果や学術的意義を評価するためにはより単純化した系が必要不可欠であると判断したため、本年度は特に、ヒト細胞との共培養を可能にする全く新しいタイプのデバイスを開発することおよび実験方法を確立することをまず主な目的とした。
上記目標に基づいて研究の全体計画は以下の内容（項目）から構成されている（本年度より一部修正）、１）in vivo 培養操作、実験プロトコルの確立：既に試作済みのデバイス(Dual Gel HFMC)を用いた方法論の確立、２）口腔内細菌の分離培養と従来法や培養を伴わない手法を用いた比較解析、３）上記技術を応用したDual Gel HFMCとは異なるタイプの培養デバイスの開発：特に培養中において増殖の様子をモニタリングすることが可能なタイプの開発、４）獲得した微生物の生理学的性質の解明、５）幅広い生物種を対象としたin vivo培養システムの開発。そのうち項目２）および３）はH25、H26両年度、４）、５）はH26年度での実施を予定していた。本年度は上記項目以外に新たにヒト細胞との共培養デバイスの開発についても手掛け、特に項目４）と５）の一部については次年度に延長しておこなうこととしたため、現段階での達成度を上記の通りに評価した。

Strategy for Future Research Activity

研究の全体計画は以下の内容（項目）から構成されている、１）in vivo 培養操作、実験プロトコルの確立：既に試作済みのデバイス(Dual Gel HFMC)を用いた方法論の確立、２）口腔内細菌の分離培養と従来法や培養を伴わない手法を用いた比較解析、３）上記技術を応用したDual Gel HFMCとは異なるタイプの培養デバイスの開発：特に培養中において増殖の様子をモニタリングすることが可能なタイプの開発４）獲得した微生物の生理学的性質の解明、５）幅広い生物種を対象としたin vivo培養システムの開発。そのうち項目１）、２）および３）はH25、H26両年度、５）はH26年度での実施し、今後は４）の一部および５）について行うことを計画している。基本的には上記の項目にしたがって計画通りに進める予定であるが、上記とは別に、ヒト細胞との共培養を可能にする全く新しいタイプのデバイスを開発することをH26年度に新たな項目として加えて今回実施したが、今後も引き続き検討を重ねる。今後は、特に項目４）に相当する微生物分離株の獲得と生理学的性質の解明、および５）口腔以外の幅広い生物種を対象としたin vivo培養システムの開発を行う予定である。とくに、Dual Gel HFMはコンパクトであるため様々な生物種に対応できるのではないかと期待できる。そのため、より小さいスケールでの培養デバイスでも有効な分離培養が可能かどうかについての検討も重ねることを予定している。

Causes of Carryover

本年度は当初の計画以外のヒト細胞との共培養システムの開発により注力した。当初の計画では分離株の獲得および生理学的性質の解明、さらに他の生物種に対応可能なデバイスの開発を行う予定であったが、研究遂行の過程で単純にin vivo（生体内）での培養だけでなく、in vitroでの培養とのちょうど中間に相当する位置づけである共培養を行うことが本研究の大きな目的を総合的に鑑みた場合必要であると判断したためである。その結果、予算消費が大きくなる遺伝子解析やその過程で必要となる消耗品などの購入が少なくなったため、当該年度の支出が少なくなり次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の計画通り、開発した培養デバイスの実証試験などをH27年度に行う。その遺伝子解析や培養操作に伴う各種消耗品や解析を外注する際に生じる経費として使用する予定である。また幅広い生物種に対応可能なデバイス開発も行うためそれに係る経費も計上する。