2013 Fiscal Year Research-status Report

新規酵素群による食品製造工程のTAB汚染解決手法の開発―極限環境適応能力の活用―

Research Project

Project/Area Number	25630386
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
Principal Investigator	森梢独立行政法人海洋研究開発機構, 海洋・極限環境生物圏領域, 技術副主事 (80463090)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	秦田勇二独立行政法人海洋研究開発機構, 海洋・極限環境生物圏領域, チームリーダー (20399562)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	微生物による変敗
Research Abstract	予め生育させたＴＡＢの菌体濁度を指標とし、酵素添加時の濁度低下をＴＡＢの溶菌活性とした簡易スクリーニングにより、応募調書記載のＴＡＢ溶菌酵素生産菌株と同程度の活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＭＢＥ２２株を取得した。本年度は、当該菌株が生産するＴＡＢ溶菌酵素の精製と、その性質ならびに遺伝情報配列の決定を行った。近年、果汁産業の国際機関であるＩＦＵ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＦｒｕｉｔＪｕｉｃｅＰｒｏｄｕｃｅｒｓ）や日本果汁協会はＴＡＢのための検査法を統一した。その一方で、企業からの聞き取りからは、製造現場では洗浄後もＴＡＢが陰性にならない事例も未だ現状としてあること、また、ＴＡＢの遺伝子を増幅することによってＴＡＢ検出する手法も流通していることから、厳密なＴＡＢの除去が求められている。ＴＡＢによる変敗の原因は、わずかでもＴＡＢが製品に混入し、増殖した場合に生じる異臭（主にグアイアコール）である。そこで、取得したＴＡＢ溶菌酵素の作用効果を判定するために、ＴＡＢの菌体増殖と、それに伴うグアイアコールの生産をペルオキシダーゼ法により測定した。その結果、３０℃条件で８時間後の菌体増殖がほとんど認められない菌体増殖誘導期においても、酵素無添加条件では検出に十分なグアイアコール産生が認められた。その一方でＭＢＥ２２株の粗酵素液（培養上清）添加条件では、同条件でグアイアコール産生が無添加条件の約９０％に抑制された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason シンプルな仮想製造条件として、製品の原料に含有されるグアイアコールの前駆体を含む条件で、溶菌粗酵素液のＴＡＢへの作用を試験した。この試験条件は、ＴＡＢ変敗の条件（ｐＨ、被検物の含有物）を備えており、なおかつ温度をＴＡＢの増殖至適に設定した場合は、製造現場で用いられるＴＡＢ検出と同等であることから、より実地に即した試験である。これまで簡易スクリーニングにより、ＴＡＢ溶菌酵素生産菌候補株が複数得られている。そのうち、本年度はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＭＢＥ２２株が菌体外に分泌する溶菌酵素をＳＤＳ－ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製し、酵素のＮ末端アミノ酸配列およびアミノ酸配列の決定を行った。
Strategy for Future Research Activity	精製し、配列情報を決定したＭＢＥ２２株が生産するタンパクは、その相同性検索結果や、顕微鏡観察によるＴＡＢ溶菌の経時的観察により、細胞壁分解に関与する酵素であることが明らかとなった。さらに、グアイアコール産生を指標とした溶菌酵素のＴＡＢへの効果は、一定時間ＴＡＢの増殖およびグアイアコールの産生を抑制する有効な結果を得ている。今後は、取得したＴＡＢ溶菌酵素のより効果的な処方条件と探索するべく、種々の細胞壁分解酵素と取得したＴＡＢ溶菌酵素の相乗的溶菌条件を探索する。また、果汁あるいは果汁飲料を含む条件でのＴＡＢ溶菌酵素のＴＡＢへの作用を試験する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	当初予定していた設備備品費の「ＰＣＲサーマルサイクラー（ＤＮＡ増幅装置）」は、所属機関で余剰となった機器が使用可能となり、購入が不要になったため。また、外部へ委託予定であった配列解析は、取得したタンパクの相同性の結果を鑑みた結果、外部委託する必要なく実施できると判断したため、予定していた費用の使用を見送った。新たに取得したＴＡＢ溶菌酵素の精製用のカラム代、酵素分解産物分析および電子顕微鏡によるＴＡＢ溶菌観察の外部委託費とする。