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2013 Fiscal Year Research-status Report

Tangoを利用した5-HT2C受容体活性のin vivoライブイメージング

Research Project

Project/Area Number 25640024
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Research InstitutionKyoto Prefectural University of Medicine

Principal Investigator

田中 雅樹  京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80264753)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 渡邊 義久  京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords5-HT2CR / Tango / GPCR / Arrestin / スクリーニング系
Research Abstract

5-HT2C受容体(5-HT2CR)活性を簡便に測定できるシステムを開発するために、Tangoと呼ばれるArrestinのGPCRへの結合を利用したシステムを5-HT2CRで構築した。まず、ショウジョウバエ用に開発されたValium-TEVcs-LexA-HA-2A-Arrestin-TEVp プラスミドを動物細胞で発現させるために、NotI-XbaI断片(TEVcs-LexA-HA-2A-Arrestin-TEVp)をpEF1のNotI-XbaI部位に挿入した。そして、TEVcsの上流(KpnI-NotI)に終止コドンを除いた5-HT2CRを挿入し、pEF1-5HT2CR-Tangoプラスミドを構築した。なお、5-HT2CRは2種類のRNA編集アイソフォーム(INIとVGV)を使用した。次に、レポーターとしてpLexOP-mini-EGFPプラスミドを構築した。このプラスミドは、CMVプロモーターの上流にLexAオペレーター配列を持ち、EGFP発現は5-HT2CRから遊離したLexAの量に依存する。なお、EGFPは通常の半減期のもの(EGFP)と短いもの(dEGFP)を使用した。
次に、5-HT2CR-Tangoの発現と細胞内局在をCOS7細胞で調べた。ウエスタンブロットの結果、全長分子、2A部位で自己切断を受けた5-HT2CR-TEVcs-LexA-HAやさらにTEVcs部位で切断を受け遊離したLexA-HA分子などのバンドが検出できた。また、免疫細胞化学解析から、5-HT2CR-Tangoは小胞体、ゴルジ体、細胞膜に存在していることも確認した。
そこで、5-HT2CR-Tangoの活性をEGFPレポーター遺伝子発現を指標に測定するために、pLexOP-mini-EGFPまたはdEGFPの安定発現細胞を作製した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

交付申請書に記載した研究計画のうち、プラスミドの構築および5-HT2CR-Tangoの発現チェックまで予定通り行えた。また、レポーターシステムの正常な作動も既に検証し、培養細胞で安定発現株も作製済みである。従って、おおむね計画通り進行している。

Strategy for Future Research Activity

5-HT2CR-Tangoシステムの動作確認を行うために、培養細胞に5-HT2CR-Tangoを導入し、アゴニスト・アンタゴニストによる受容体活性の測定行う。さらにES細胞へも導入し、神経分化させた細胞での5-HT2CR活性のモニタリングを同様に行う予定である。

  • Research Products

    (11 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (5 results) Book (1 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Differential expression of alpha-synuclein in hippocampal neurons.2014

    • Author(s)
      Taguchi K, Watanabe Y, Tsujimura .A, Tatebe H, Miyata S, Tokuda T, Mizuno T, Tanaka M.
    • Journal Title

      PLoS ONE

      Volume: 9 Pages: e89327

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0089327

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Enhancement of alcohol drinking in mice depends on alterations in RNA editing of serotonin 2C receptors.2014

    • Author(s)
      Watanabe Y, Yoshimoto K, Tatebe H, Kita M, Nishikura K, Kimura M, Tanaka M
    • Journal Title

      Int J Neuropsychopharmacol

      Volume: in press Pages: in press

    • DOI

      in press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Behavioral analysis of relaxin-3 deficient mice2013

    • Author(s)
      Tanaka, M., Furube, E., Aoki, M., Watanabe, Y.
    • Journal Title

      Ital J Anat Embryol

      Volume: 118 Pages: 56-59

    • DOI

      10.13128/IJAE-13893

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Development of Tango live imaging system of 5-HT2CR activity

    • Author(s)
      Watanabe Y, Tsujimura A, Taguchi K, Aoki M, Tanaka M
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会
    • Place of Presentation
      神戸
  • [Presentation] Involvement of 5-HT2CR-editing in alcohol preference.

    • Author(s)
      Watanabe Y, Yoshimoto K, Tatebe H, NIshikura K, Kimura M, Tanaka M.
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego, USA
  • [Presentation] 5-HT2C受容体RNA編集の脳高次機能への役割

    • Author(s)
      青木美空、渡邊義久、吉本寛司、田中雅樹
    • Organizer
      日本行動神経内分泌研究会 第4回関西支部会
    • Place of Presentation
      京都
  • [Presentation] 5-HT2C受容体RNA編集のアルコール嗜好性への関与

    • Author(s)
      渡邊義久、吉本寛司、木村實、田中雅樹
    • Organizer
      日本行動神経内分泌研究会 第4回関西支部会
    • Place of Presentation
      京都
  • [Presentation] Symposium:Protein Metabolism and Homeostasis in Aging. Exoression and Lewy Body-like Aggregation of alpha-synuclein in cultured cells.

    • Author(s)
      Tanaka M.
    • Organizer
      1st Annual World Congress of Geriatrics and Gerontology
    • Place of Presentation
      Dalian, Chiana
  • [Book] Alpha-Synuclein: Functional Mechanisms, Structure and Role in Parkinson’s Disease2013

    • Author(s)
      Watanabe, Y., Tsujimura, A., Taguchi, K., Tanaka, M.
    • Total Pages
      29-50
    • Publisher
      Nova Science Publishers Inc
  • [Remarks] 基礎老化学(教室ホームページ) 研究業績

    • URL

      http://www.f.kpu-m.ac.jp/k/cellbio/Pub_list.html

  • [Remarks] 大学ホームページ 研究室紹介

    • URL

      http://www.kpu-m.ac.jp/doc/classes/fuzoku/noukekkan/239.html

URL: 

Published: 2015-05-28  

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