2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25640057
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
米川 博通 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 特任研究員 (30142110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
設楽 浩志 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 主任基盤技術研究職員 (90321885)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | mtDNA / 遺伝子操作 / 人工ヌクレアーゼ / ミトコンドリア内局在型 / マウス / トランスジェニックマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題では、哺乳類ミトコンドリアDNA（mtDNA）の人工ヌクレアーゼの手法による遺伝子操作技術の開発を目的としている。本年度は、昨年度に作製したTALEN (transcription activator-like effector nuclease)法の原理を応用したミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターの改良とその機能検証を中心に取り組んだ。昨年度の問題点であった発現の不安定性の改善を目的とし、別の強発現ベクターへミトコンドリア局在型TALENの配列を組み込んだベクターを構築した。構築したベクターを細胞へトランスフェクトし免疫染色により検証した結果、多少の改善効果が認められたケースがあったものの、明確な発現の増強が確認されるまでには至らなかった。構築した本ベクターには選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子が組み込まれており、これら選択マーカーを用いた安定発現細胞の単離を試みた。各ベクターを培養細胞へトランスフェクトし、選択培地にて培養した後にコロニーを単離した。各コロニーについて発現量を比較するために、各コロニー由来の細胞からRNAを調製し、リアルタイムPCR法による定量解析を行った。その結果、幾つかの高発現が認められた細胞株が単離されたが、免疫染色像からはその安定性が認められなかった。現在、さらに導入遺伝子の高発現安定細胞株の単離を試みている。一方で、ミトコンドリア局在型TALEN の配列を用いてRNAを合成し、マイクロインジェクション法によりマウス初期胚へ導入し、欠失の変異導入の有無を検証したが、現時点では変異導入は認められていない。
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