腫瘍ゲノム解析として転座・逆位を含む包括的構造解析を可能とする新規システムの開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25640078
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 水野 晋一 九州大学, 先端医療イノベーションセンター, 准教授 (40569430)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ゲノム解析 / ゲノム構造異常

Research Abstract

腫瘍のゲノム解析は、原因遺伝子の探索をはじめ腫瘍診断に重要な検査法である。現在、網羅的ゲノム解析としてはCGH（comparative genomic hybridization）法があり、その解析解像度は飛躍的に向上している。しかし、CGH法は、ゲノムのコピー数異常（増幅・欠失）の検出は可能であるが、転座・逆位等の構造異常の検出には適していない。本研究では、転座・逆位を含む包括的なゲノム構造解析を高精度・高感度に可能とする新規システムを開発し、腫瘍解析へ応用する。本システムの原理は、環状化DNAの結合両末端（メイトペア）解析を基本としている。ゲノム・ライブラリーの各DNA断片へ固有塩基配列を導入し、シンプルな２段階DNA環状化を行うことで、「単分子DNA環状化」由来のみの正確なメイトペア配列をコンピューター上（in silico）で選別可能とする新規のシステムである。そこで、まずゲノム構造異常を高精度・高感度に解析可能な新規システムの確立を行い、システム上の各ステップの条件の最適化を行うとともに、微量クローンのゲノム構造変異の検出にも臨床応用することが可能な信頼性の高いシステムを確立する。本システムの確立と臨床応用は、腫瘍ゲノムのコピー数のみならず転座・逆位の解析を可能とし、同時に微量クローン解析に応用でき、経済性にも優れた方法であることから、腫瘍の診断・研究に役立つと期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノム構造異常を解析することができる新規システムの確立とともに、高精度・高感度の解析を可能とするためシステム上の各ステップの条件最適化を行った。
ゲノム構造解析には、DNAを制限酵素により部分消化したDNA断片を使用した。このDNA断片へ付加するアダプターは制限酵素サイト（X）、制限酵素サイト（Y）および特異的塩基配列（N）から構成されており、特異的配列のランダム塩基（N）は同一アダプター内では同じ配列が並ぶように設計した。本アダプターをDNA断片に付加した後、制限酵素（X）で切断後に１段階目の自己環状化を行い、次に制限酵素（Y）により特異的配列の間で切断し、２段階目の自己環状化を行う。この２段階DNA環状化により、アダプター内の特異的配列の組み合わせパターンが変化し、その組み合わせによりクローンを選別する。つまり、シークエンサーによる配列解析後に、（a）Right：特異的配列が同一組み合わせである「正確なメイトペア」、（b）Error：特異的配列の組み合わせが合致しない「偽のメイトペア」、（c）Incomplete：環状化過程が正常に進行しなかった「不完全なメイトペア」に区別することができ、これらをコンピューター上で選別することで、正確なメイトペア配列情報のみを抽出することが可能となる（in silico selection）。
本年度、この各ステップの最適化に概ね成功している。ただ一部に制限酵素での切断不全により２段階環状化が進まないクローンがノイズとして混入しており、改善を行う余地が残されている。

Strategy for Future Research Activity

平成２６年度は、まず本システムの条件設定について最適化の検討を継続する。特に、極く微量ではあるが制限酵素での切断不全のために２段階環状化が阻害され、一部にクローンの選択不全が起こりノイズとして混入してしまう問題があり、システムの高精度化のためにアダプターの改良を中心にこの問題の改善を行う。一方、本法はシステムとしてはすでに稼働しており、本システムを造血器悪性腫瘍の細胞株および臨床検体を対象に、CGH法との比較を中心として実証研究を実施する。そのため、血液系細胞株（K562、THP-1）および急性骨髄性白血病（AML）５症例を対象として本システムを導入する。また、本システムでは血中に存在する微量クローンの解析にも効果を発揮することが期待されるため、腫瘍初期の解析実証として成人T細胞性白血病（ATL）解析を準備している。具体的には、既知の構造異常を有するATL細胞株の希釈系列について本システムによる解析を行い、システムの検出感度を検討する。さらに、これらの過程で臨床検体に転座あるいは逆位の構造異常がみられた症例については、サザンブロッティングによる確認を行い、本システムがゲノム構造解析法として確立され広く用いられるべく検証を行う。

Research Products

• [Journal Article] p600 Plays Essential Roles in Fetal Development (2013)
  • Author(s): Nakaya T, Ishiguro KI, Belzil C, Rietsch AM, Yu Q, Mizuno SI, Bronson RT, Geng Y, Nguyen MD, Akashi K, Sicinski P, Nakatani Y
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 8(6) Pages: e66269
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0066269
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A case of 8p11 myeloproliferative syndrome with BCR-FGFR1 gene fusion presenting with trilineage acute leukemia/lymphoma, successfully treated by cord blood transplantation (2013)
  • Author(s): Morishige S, Oku E, Takata Y, Kimura Y, Arakawa F, Seki R, Imamura R, Osaki K, Hashiguchi M, Yakushiji K, Mizuno S, Yoshimoto K, Nagafuji K, Ohshima K, Okamura T
  • Journal Title: Acta Haematol. Volume: 129(2) Pages: 83-89
  • DOI: 10.1159/000341289
  • Peer Reviewed