2013 Fiscal Year Research-status Report
アデノ随伴ウイルスを利用した特異性の高いヒト細胞ゲノム編集技術の開発
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25640107
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
小西 裕之 愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / アデノ随伴ウイルスベクター |
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| Research Abstract |
アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくターゲッティングベクターは、従来のプラスミドベクターの1,000倍以上のゲノム編集効率を達成するとされる。また、DNA二重鎖切断を誘発しないため、ランダムなゲノム異常を誘導しにくいと考えられる。このような特徴から、AAVターゲッティングベクターは相同組換え効率の低いヒト細胞株でのゲノム編集に頻繁に使用されてきた。
本研究では、AAVターゲッティングベクターの長所を生かしつつそのゲノム編集効率をさらに向上することを目指す。将来的には、様々な種類のヒト細胞・ヒト細胞株において自在にゲノム編集を行いうる手法の開発を究極の目標とする。本年度はまず、AAVターゲッティングベクターにおける効果的なネガティブ選択（NS）システムを確立するため、スプライスアクセプター（SA）、2A、蛍光遺伝子（EGFPまたはDsRed）からなるNSカセットを構築した。これをSA、2A、薬剤耐性遺伝子からなるポジティブ選択（PS）カセットを持つAAVターゲッティングベクターの5′側末端に挿入した後、構築したベクターを細胞株に導入し、蛍光フローサイトメトリー（FCM）によって解析した。その結果、一過性導入の段階ではNSカセットに用いた蛍光遺伝子2種類のうちEGFP遺伝子の方がより明瞭な陽性シグナルを示した。一方、薬剤によるポジティブ選択を行った後の細胞株では、どちらの蛍光遺伝子も大多数の細胞で発現が消失していた。
NSシステムは、プラスミドベクターにおいては発現・機能が限定的であり、ゲノム編集クローンを濃縮（enrichment）する効果が数倍程度に留まることが従来の研究で報告されている。NSカセットの構造に違いはあるが、本研究のこれまでの結果もプラスミドベクターにおける状況に類似する結果となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究で作成したAAVターゲッティングベクターのPSカセット、NSカセットは、ともにSAと2Aが選択マーカーの上流に配置されており、両者の読み枠は一致させてある。すなわち、このベクターがランダムにゲノムへ挿入された細胞では、原則として両カセットから均等に転写・翻訳が誘導される。一方、イントロンの長さが短いほどスプライシングが効率よく起きる場合は、PSカセットよりNSカセットの方が優位に転写・翻訳されるはずである。しかし、このベクターを導入した後に薬剤選択（ポジティブ選択）した細胞を解析したところ、大多数の細胞においてNSカセット由来の蛍光シグナルは認められなかった。すなわち、PSカセットだけが転写・翻訳され、NSカセットは転写・翻訳されていないものと判断された。なお、これらの細胞でターゲッティングベクターがゲノムにランダムに挿入されていることは別途確認した。
ベクター構築用のDNA配列として複数の異なるSA、2Aが汎用されている。これらの組み合わせにより転写・翻訳効率が変わる可能性を考慮し、次に、最初に用いた組み合せと別種のSA、2Aを使用してベクターを作成した。また、2Aに代えて内部リボソーム進入部位（IRES）配列を用いたベクターも作成した。しかし、これらのベクターを導入した細胞の解析でも、薬剤選択後の大半の細胞において蛍光は検出されなかった。
以上のように、本年度は、AAVターゲッティングベクター中に組み込むNSカセットの設計について予定よりも長期間にわたる試行錯誤を必要とした。そのため、NSカセット由来の蛍光シグナルによるFCM解析（ソーティング）や、それに続くゲノム編集クローンの濃縮の評価まで研究が進展しなかった。よって、現在までの本研究課題の達成度はやや遅れているものと判断された。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のように、AAVターゲッティングベクター導入後に薬剤選択した細胞の大半でNSカセット由来の蛍光シグナルは検出されなかった。しかし、FCM解析を薬剤選択後ではなくターゲッティングベクター導入後2～3日目に行ったところ、GFP陽性細胞が一定の割合で検出された。したがって、NSカセットはベクター導入直後には機能・発現するが、何らかの理由により薬剤選択期間中にその発現が消失するものと示唆された。
上記の結果から、今後、ベクター中の薬剤耐性遺伝子をネオマイシン耐性（NeoR）遺伝子からピューロマイシン耐性（PuroR）遺伝子に変更して同様の解析を行う方針とする。この変更により、ターゲッティングベクター導入後の薬剤選択を2～3日間に短縮することができ、ベクターがゲノムにランダム挿入された細胞においてNSカセットの機能・発現が維持された状態で細胞のFCM解析を行うことができる。したがって、FCM解析で蛍光陰性細胞を回収（ソーティング）し、ゲノム編集細胞を濃縮することにより、効率的なゲノム編集を実施できるものと期待される。
また、当初からの予定に従い、今後PSマーカーとNSマーカーの両方に蛍光遺伝子を用いたAAVターゲッティングベクターを試用する。このようなベクターによるゲノム編集では、薬剤選択を行う必要はなく、ベクターが細胞に安定導入された直後、すなわち感染数日後からFCM解析によるスクリーニングを実施することができる。なお、作成予定のターゲッティングベクターはプロモータートラップ型でありプロモーターを含有しないため、理論上、一過性導入の段階の細胞はFCM解析で蛍光陽性にならない。このようなベクターの使用により、ゲノム編集の成否について早期に最初の手がかりを得ることができるため、迅速かつ高効率なゲノム編集が可能になるものと期待される。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度、数種類の蛍光遺伝子を用いてNSカセットを作成し、それぞれのNSカセットによるゲノム編集細胞の濃縮の程度を比較検討する予定であった。具体的には、作成した複数のNSカセットをそれぞれAAVターゲッティングベクターに組み込み、構築したベクターを細胞に導入した後、FCM解析（ソーティング）により蛍光陰性の細胞を回収し、得られた細胞検体におけるゲノム編集の効率を計測する予定であった。
ところが、実際にはNSカセットからの蛍光遺伝子の発現を確認するまでに予想以上の長期間にわたって実験条件の調整を行う必要があった。そのため、蛍光シグナルを用いたFCM解析（ソーティング）や回収した細胞におけるゲノム編集効率の計測を行う段階まで研究が進展しなかった。そこで、これらの実験を平成26年度に行うため、必要経費を次年度使用額として移行させることとなった。
「今後の推進方策」に記したように、ターゲッティングベクターを細胞に導入した後2～3日間はNSカセットが機能することが示唆されている。このことから、薬剤選択（ポジティブ選択）にピューロマイシンを用いることにより、NSカセットの発現・機能が3日目以降に減衰する問題は克服できる見込みである。そこで、本年度に実施できなかった蛍光陰性細胞のソーティングおよび回収した細胞の解析によるゲノム編集細胞の濃縮の検討を、次年度使用額を利用して平成26年度に行う予定とする。
また、PSマーカーとNSマーカーの両方に蛍光遺伝子を用いたターゲッティングベクターを試作し、細胞に導入してFCM解析を行う実験は、当初から平成26年度の実施予定であり、以前から計上されていた同年度予算を利用して行う。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Single copies of mutant KRAS and mutant PIK3CA cooperate in immortalized human epithelial cells to induce tumor formation.2013
Author(s)
Wang GM, Wong HY, Konishi H, Blair BG, Abukhdeir AM, Gustin JP, Rosen DM, Denmeade S, Rasheed Z, Matsui W, Garay JP, Mohseni M, Higgins MJ, Cidado J, Jelovac D, Croessmann S, Cochran R, Karnan S, Konishi Y, Ota A, Hosokawa Y, Argani P, Lauring J, and Park BH.
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Journal Title
Cancer Res
Volume: 73
Pages: 3248-3261
DOI
Peer Reviewed
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