2013 Fiscal Year Research-status Report
人工染色体を用いた長鎖非コードRNA関連分子の同定
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25640114
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
久郷 裕之 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40225131)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 人工染色体 / 長鎖非コードRNA / 免疫沈降 / XIST / LIT1/KCNQ1OT1 |
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| Research Abstract |
これまで、人工染色体を利用した特定のゲノム領域に集積するクロマチンータンパク質、あるいはクロマチンーRNA の複合体を染色体領域上の機能的複合体としてそのまま回収し、解析するユニークな新しい技術の開発(染色体免疫沈降法：Chromosomal Immunoprecipitation; ChrIP)を進めてきた。その結果、我々が得意としリードしてきた染色体工学技術を用いて、大きさに制限無く複数のゲノム領域や遺伝子を搭載できるMulti-gateway システムを組み込ませた人工染色体ベクターへ、完全長なLIT1/ KCNQ1OT1 およびXist 遺伝子を含んだBACの搭載を行ってきた。しかし、詳細な解析の結果、これらの遺伝子（RNA）はともに、シスにクロマチン上をコーティングすることによって転写抑制に働く特性から、人工染色体に搭載させた薬剤耐性遺伝子も不活化されたことが原因で、LIT1/ KCNQ1OT1 およびXist 遺伝子を含む人工染色体の構築ができなかった。そこで本研究では、LIT1/KCNQ1OT1、Xist領域を保持する人工染色体をTet-onシステムを用いてconditionalに標的ゲノム領域を発現誘導できるように改変した。さらに、LIT1/KCNQ1OT1を搭載した人工染色体をrtTA安定発現HeLa細胞へ、Xistのゲノム領域をもつ人工染色体をrtTA安定発現株NIH/3T3細胞へ微小核融合法を用いて移入した。一方、それぞれの人工染色体を移入した細胞内においてDox添加によるLIT1/KCNQ1OT1、Xistの発現が誘導され、DNA-FISH法により人工染色体の安定性を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LIT1/KCNQ1OT1、Xistから発現されるRNAは、自身の染色体上へシスに局在し、局所的、染色体全体を不活化する。そのため、LIT1/KCNQ1OT1、Xistのゲノム領域を強制発現させるCAGプロモーターでは、人工染色体上にある薬剤選択マーカーまで不活化することがわかった。そのため、Tet-onを用いてconditionalに標的ゲノム領域を発現誘導できるように改変した。それぞれ標的ゲノム領域/タグ配列を搭載した人工染色体はCHO細胞に保持されているため、CHO細胞内でのrtTA/Dox添加誘導におけるLIT1/KCNQ1OT1、Xist発現を確認した。またCHO細胞内でのDNA FISH法を用いて、CHO細胞内で人工染色体の安定性を確認した。さらに、DNA-RNA FISH法を用いて人工染色体上へのLIT1/KCNQ1OT1、Xist RNAの局在を確認した。このことをもってChrIP法で用いる人工染色体の完成とした。
完成した人工染色体をCHO細胞からそれぞれrtTA安定発現HeLa細胞、NIH/3T3細胞へ微小核融合法を用いて移入した。人工染色体を移入したそれぞれの細胞は、DNA FISH法により人工染色体の安定性を確認し、Dox添加発現誘導後、qRT-PCRによって搭載ゲノム領域のRNA発現を確認した。また、DNA-RNA FISHによる人工染色体上へのLIT1/KCNQ1OT1、Xist RNAの局在も確認した。Xistを搭載した人工染色体においては、Dox発現誘導ではDAPIによる人工染色体の凝集も確認した。
より親和性の高い抗体での人工染色体回収を行うため、LacI-GFP-3xFLAG/抗FLAG抗体でのIPを検討し、LacI-GFP-3xFLAGのコンストラクトを作製した。作製したコンストラクトを細胞へ導入し、24hrs後GFP蛍光を確認した。完成したコンストラクトを導入した細胞よりタンパクを抽出し、SDS-PAGE後、ウェスタンブロットでFLAG、GFPを確認した。このことから作製したLacI-GFP-3xFLAGの完成とし、ChrIP法に必要な資材の完成とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
LIT1/KCNQ1OT1、Xist領域をそれぞれ搭載した人工染色体を保持するrtTA安定発現HeLa、NIH/3T3細胞を用いてChrIPを行う。それぞれの人工染色体には、IPに必要なタグ(LacO)配列が搭載してあるため、その細胞へLacI-GFP-3xFLAG融合タンパクを発現させ、Doxによる機能性RNAを発現させた後、人工染色体上に集積する複合体の回収を試みる。回収した複合体をSDS-PAGEにより精製した後、MS解析を用いて、標的ゲノム領域に集積した複合体を同定する。このとき、タグ配列のみの人工染色体をコントロールとして、集積する複合体のバックグラウンド軽減をはかる。MS解析によって同定された複合体は、データベースを用いて、タンパク/タンパク、DNA/タンパク、RNA/タンパク結合の整合性を評価する。その後、RNA-TRAP法、ChIP assayでの結合を評価し、標的ゲノム領域/集積RNAとの関連性をノックダウン実験、過剰発現実験により同定した複合体の機能評価を行う。
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