2014 Fiscal Year Annual Research Report
人工染色体を用いた長鎖非コードRNA関連分子の同定
| Project/Area Number |
25640114
|
|---|
| Research Institution | Tottori University |
|---|
Principal Investigator |
久郷 裕之 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40225131)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | Xist / X染色体不活化 / LIT1 / DNA/RNA/タンパク複合体解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
これまで人工染色体上へ長鎖非コードRNA (lncRNA) Xist、LIT1を搭載した。しかし、これらのlncRNA は、人工染色体上へのシス集積が観察されたものの、人工染色体上に座上する薬剤耐性遺伝子の発現抑制は認められなかった。このことから、人工染色体上には、これらのlncRNAによる遺伝子抑制に必要な配列因子が欠如している可能性が示唆された。本研究においては、完全長なヒト21番染色体への標的遺伝子搭載を実施した。はじめに、ヒト21番染色体を保持するCHO細胞内において、部位特異的組換え反応により標的遺伝子のヒト21番染色体上へ搭載を試みた。その結果、FISH解析により薬剤依存的に発現されたXist RNAシグナルとヒト21番染色体DNAシグナルの共局在が認められた。さらに、ヒト21番染色体上へ不活性化ヒストン修飾H3K27me3の局在も認められた。このことより、Xist RNAのヒト21番染色体上へ集積および染色体の不活性化の誘導が示唆された。一方、LIT1においては、同様に21番染色体へ搭載を完了した。
これまで、LacO/LacIをタグとした染色体回収を試みたが、長大なリピート配列の不安定性からその実現性が困難であると判断した。そのために、新たにゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を取り入れた染色体回収システムの確立を試みた。はじめに、Cas9の切断活性を失活させ、FLAGおよびEGFPを融合させたFLAG/dCas9-EGFPおよびヒト動原体を標的としたgRNAを作製した。免疫蛍光染色によりFLAGとEGFPの局在を評価した結果、FLAGとEGFPの蛍光は共局在を示した。このことより、FLAG/dCas9-EGFPの構築に成功した。
今後は標的遺伝子を搭載したヒト21番染色体をNIH/3T3細胞へ導入し、FLAG抗体を用いた染色体回収およびMS解析を試みる。
|
