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2013 Fiscal Year Research-status Report

DNA1分子レベルでの形態制御技術を用いたDNA複製反応制御機構の解析

Research Project

Project/Area Number 25650002
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Research InstitutionGunma University

Principal Investigator

桂 進司  群馬大学, 理工学研究科, 教授 (10260598)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大重 真彦  群馬大学, 理工学研究科, 准教授 (00451716)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
KeywordsDNA複製 / 1分子観察 / DNA形態制御 / DNA超らせん
Research Abstract

1分子解析技術を用いて、DNA代謝反応制御における超らせん構造の役割を解析するためには、1分子レベルでの超らせん構造の導入システムを構築する必要がある。そこで、平成25年度の研究により、1分子レベルでDNAへ超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムを開発し、超らせん構造を導入したDNA分子の挙動を1分子レベルで解析することができた。
また、本研究では超らせん歪を導入したときのDNA複製起点近傍のDNA2次構造の変動に着目し、本研究で開発した超らせん導入システムと1本鎖領域標識のための蛍光RPAとを組み合わせることにより、超らせん構造の導入によるλDNAの複製起点の二次構造変動の様子をリアルタイムに観察した。現在、これらの成果を学術論文として投稿する準備中である。
今後の研究に必要となる各種DNA複製関連因子の蛍光標識の調製やSV40(Simian virus 40)の複製起点がクローニングされたλDNA(SV40ori-λDNA)などの鋳型DNAや各種酵素やタンパク質の作製は順調に進んでいる状態である。今後、複製起点近傍のDNA2次構造変動の精密解析やSV40DNAのin vitro複製系の再構成に必要な因子の調製、蛍光標識を進めていく予定である。さらに、蛍光標識した複製因子に基づき、DNA複製系を顕微鏡視野内において1分子レベルで再構成し、そのときの超らせん構造の役割について解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度のDNAへ超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムの構築は完成しており、1分子レベルでの超らせん構造を導入したDNA分子の挙動を解析することができた。
構築した超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムを用い、超らせん歪導入時のDNA2次構造の変動をDNA複製起点に着目し解析を行い、超らせん構造の導入によりDNA複製起点の二次構造変動の様子を蛍光により解析できたため、ここまでの研究結果を学術論文にするためにまとめている状況である。
また、1分子観測に必要な各種DNA複製関連因子の蛍光標識の調製やSV40(Simian virus 40)の複製起点がクローニングされたλDNA(SV40ori-λDNA)などの鋳型DNAなどDNAやの作製は順調に進んでいる状態であるため、ほぼ研究計画に沿いながらおおむね順調に進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今回構築した超らせん状態を導入しながら蛍光解析を行うシステムと蛍光標識されたDNA複製関連因子を用いて、再構成系において超らせん導入時におけるDNA複製反応を1分子レベルで可視化し、解析を進めていく。
具体的には、蛍光RPAなどによる構造変動の可視化とオプティカルマッピングとを組み合わせることにより、ウイルスやファージなどの複製起点近傍の構造変動をさらに詳細に解析し、DNA複製開始とDNA複製バブル形成における超らせん構造の役割についての知見を深めていく。
また、SV40ラージT抗原や各種複製因子の蛍光標識化を進め、再構成系においてDNA複製フォークを観測を試み、そのときの超らせん構造の役割について解析を行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本研究の推進のために必須なDNAポリメラーゼ合成の可視化およびヌクレアーゼ反応の可視化の実験を優先的に進めたために、一部の研究費を次年度に繰り越した。
昨年度から繰り越された予算も活用し、DNA複製起点近傍の超らせん導入による構造変動解析およびDNA合成反応の可視化に関する研究を進める予定である。

  • Research Products

    (4 results)

All 2014 2013

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] A new direct single-molecule observation method for DNA synthesis reaction using fluorescent replication protein A2014

    • Author(s)
      S. Takahashi, S. Kawasaki, H. Miyata, H. Kurita, T. Mizuno, S. Matsuura, A. Mizuno, M. Oshige and S. Katsura
    • Journal Title

      Sensors

      Volume: 14(3) Pages: 5174-5182

    • DOI

      10.3390/s140305174

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Direct Observation of Fluorescently Labeled Single-stranded λDNA Molecules in a Micro-Flow Channel2013

    • Author(s)
      Shunsuke Takahashi & Shohei Kawasaki & Koji Yamaguchi & Hidefumi Miyata & Hirofumi Kurita & Takeshi Mizuno & Shun-ichi Matsuura & Akira Mizuno & Masahiko Oshige & Shinji Katsura
    • Journal Title

      J Fluoresc

      Volume: 23 Pages: 635-640

    • DOI

      10.1007/s10895-013-1210-1

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Direct observation of fluorescently labeled single-stranded λDNA molecules in a micro-flow channel2013

    • Author(s)
      S. Takahashi, S. Kawasaki, K. Yamaguchi, H. Miyata, H. Kurita, T. Mizuno, S. Matsuura, A. Mizuno, M. Oshige and S, Katsura
    • Organizer
      5th International Conference on Advanced Micro-Device Engineering
    • Place of Presentation
      Kiryu, Gunma, Japan
    • Year and Date
      20131219-20131219
  • [Presentation] 蛍光複製タンパク質A を用いた1本鎖DNA 標識によるDNA 合成反応のリアルタイム1分子観察2013

    • Author(s)
      高橋 俊介,川崎 祥平,宮田 英史,栗田 弘史,水野 武,松浦 俊一,水野 彰,大重 真彦,桂 進司
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206

URL: 

Published: 2015-05-28  

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