2014 Fiscal Year Research-status Report
ＤＮＡ１分子レベルでの形態制御技術を用いたＤＮＡ複製反応制御機構の解析
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25650002
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
桂 進司 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (10260598)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大重 真彦 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (00451716)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 超らせん / ＤＮＡ２次構造 / DNA複製制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ＤＮＡの負の超らせんはバブル構造、十字構造、Ｚ型ＤＮＡなどの非Ｂ型構造を誘導することが知られており、転写やＤＮＡ複製などのＤＮＡ代謝の反応に関与することが示唆されている。しかしながら、電気泳動などの多分子解析法では分子の平均的な挙動しか解析できないために、ＤＮＡ代謝反応における負の超らせんＤＮＡの生理学的役割について極めて限られた知見のみしか得られていないのが現状である。そこで、本研究では個々のＤＮＡへ負の超らせんを導入しながらＤＮＡの構造変動や代謝過程の１分子解析を試みた。具体的には、微細流路装置と磁気ピンセットを組み合わせたＤＮＡ形態制御装置を開発し、蛍光顕微鏡によるイメージングを組み合わせることで、負の超らせんＤＮＡの構造変動について解析した。その結果、負の超らせんを導入したλDNAとSV40（Simian virus 40）の複製起点領域をクローニングしたλDNAのSV40ori-λDNAでは、局所的な開裂が蛍光Replication Protein A（RPA）結合による蛍光輝点として観察され、それらの輝点の位置はＤＮＡ複製起点のA+T-rich領域と対応することが明らかになった。
既存の文献においてもＤＮＡの負の超らせんによるＤＮＡ複製起点の局所的な開裂はＤＮＡ複製開始の制御に関与することが示唆されているので、ＤＮＡ複製開始制御における負の超らせんの生理学的役割についてさらなる解析を進め、本年度はSV40ori-λDNAを用い、SV40巨大腫瘍抗原（SV40-TAg）による複製起点配列特異的なＤＮＡ解鎖に対して負の超らせんを与えたときの影響を蛍光ＲＰＡによる観察により解析した。その結果、ＤＮＡへ負の超らせんを導入することにより、SV40-TAg依存的なＤＮＡ解鎖が強く促進されることが明らかになった。現在、これらの研究結果を学術論文としてまとめている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度から平成２６年度途中までは微細流路装置と磁気ピンセットを組み合わせたＤＮＡ形態制御装置を開発し、蛍光顕微鏡によるイメージングを組み合わせることで、負の超らせんＤＮＡの構造変動について明らかにした。具体的には、λDNAとSV40ori-λDNAでは負の超らせんの導入により１本鎖領域が誘導され、その領域は各々の複製起点のA+T-rich 領域付近であることが明らかになった。また、その負の超らせん導入によるλDNAとSV40ori-λDNAの複製起点への局所的な開裂は負の超らせん密度を増加することで輝点の存在確率もそれぞれ上昇することが明らかになった。これら研究成果は分析化学部門で権威があるAnalytical Chemistry（ACS）誌にて掲載された。
また、ＤＮＡ複製開始制御における負の超らせんによる生理学的役割についてさらなる解析を進めるため、平成２６年度ではSV40ori-λDNAへ負の超らせんを与えたときのSV40-TAg依存的なＤＮＡ解鎖の影響について解析を行った。具体的には、負の超らせんを導入したSV40ori-λDNA において、SV40-TAg依存性ＤＮＡ解鎖により得られた１本鎖領域を蛍光RPAにより標識し、蛍光観察により解析した。興味深いことにSV40-TAg依存的なＤＮＡ解鎖は負の超らせんの導入により促進されることが明らかになった。現在、これらの研究結果を学術論文にまとめている。本研究にて開発したＤＮＡへ負の超らせん形態を導入しながらＤＮＡ代謝過程を１分子イメージングにて解析する技術は、先駆的な解析技術として世界の研究に対して大きなインパクトを与えることができると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度には、本研究で開発した微細流路装置と磁気ピンセットによるＤＮＡ形態制御装置及び蛍光顕微鏡によるイメージングを組み合わせた１分子解析技術を適用することにより、ＤＮＡに負の超らせんを導入することによりSV40-TAg依存的なＤＮＡ解鎖は強く促進されることが明らかになった。この結果に基づき、真核生物系の異なる生物種のＤＮＡ複製開始について負の超らせん状態がどのように生理学的役割において影響を与えるのかについて、引き続き、１分子レベルで解析を進めていく。これまでの多分子解析によっても、真核生物である出芽酵母、分裂酵母、ショウジョウバエ、後生動物のＤＮＡ複製開始において、ＤＮＡへ負の超らせんを導入ときにＤＮＡ複製の開始が促進されることや複製起点の決定などに関与する可能性があることが示されている。しかしながら、多分子解析では様々な超らせん状態のＤＮＡが解析の対象となってしまうために、負の超らせんＤＮＡにより促進されたＤＮＡ複製開始の詳細な情報は覆い隠されてしまうと考えられる。そこで、本研究にてこれまでに遂行してきた１分子解析技術を適応することで解析を進めていく。
具体的な生物種において、既に報告がなされている真核生物の出芽酵母、分裂酵母、ショウジョウバエ、ヒトなどから遂行していくことを考えている。特に、ショウジョウバエやヒトの自己複製配列は未だ定められていないため負の超らせんがＤＮＡ複製起点に対してどのような影響を与えるのか、負の超らせん状態がＤＮＡ複製開始決定ポイントとしての因子となりうるのかを慎重に検討をして行く予定である。そのために、まずＤＮＡ複製起点となり得る遺伝子のλＤＮＡへクローニングやＤＮＡ複製開始に必要な因子の調製を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究の推進のために必須な負の超らせん導入によるＤＮＡ２次構造変動解析を進めたために、一部の研究費を次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
昨年度から繰り越された予算も活用し、SV40 in vitro複製系の複製開始制御において、負の超らせんが果たしている役割を解析する。
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Research Products
(4 results)
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[Journal Article] Direct Single-Molecule Observations of Local Denaturation of a DNA Double Helix under a Negative Supercoil State2015
Author(s)
S. Takahashi, S. Motooka, T. Usui, S. Kawasaki, H. Miyata, H. Kurita, T. Mizuno, S. Matsuura, A. Mizuno, M. Oshige, S. Katsura
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Journal Title
Analytical Chemistry
Volume: 87
Pages: 3490-3497
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Real-time single-molecule observations of T7 Exonuclease activity in a microflow channel,2014
Author(s)
S. Takahashi, T. Usui, S. Kawasaki, H. Miyata, H. Kurita, S. Matsuura, A. Mizuno, M. Oshige, S. Katsura
Organizer
1st International Symposium of Gunma University Medical Innovation and 6th International Conference on Advanced Micro-Device Engineering (GUMI&AMDE2014)
Place of Presentation
Kiryu, Gunma, JAPAN
Year and Date
2014-12-05 – 2014-12-05
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