2016 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of an over-expression system for mammalian large membrane proteins
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25650020
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小川 治夫 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 准教授 (40292726)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 大量発現 / 膜蛋白質 / アデノウィルス / 超巨大蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、申請者が実用化を行ったアデノウィルス/哺乳類培養細胞発現・精製システムを更に発展させ、哺乳類由来の超巨大膜蛋白質を発現するシステムの構築を行うことにある。そのために、通常のアデノウィルス構築に用いる市販のシステムから、更にE4遺伝子を欠損させたシステムを用い、より大きな遺伝子の発現が可能な系の立ち上げを試みた。E4遺伝子が欠損した変異アデノウィルスの増幅には、感染細胞へのE4遺伝子の外部からの供給が必須である。その一方、E4蛋白質は強力な細胞毒性を持つため、一過的にE4遺伝子を発現する系の構築の必要があった。そこで、哺乳類に感染可能なバキュロウィルスにE4遺伝子を組み込み、一過的にE4遺伝子を大量に発現できる系の構築を行ったが、予想外にこの系の立ち上げに多くの時間を費やした。本系を用いて、GFP遺伝子を発現する変異アデノウィルスの作成には成功し、現在では一応のプロトコルが定まったが、得られるウィルスの力価が弱い等の問題に直面した。これは、本系の利用には培養細胞に変異アデノウィルスと変異バキュロウィルスとを同時に感染させる必要があることに起因する。本問題の解決のために、両者の培養液への添加のタイミングや、添加ウィルス量の調節といった種々のパラメーターを変え、検討を行ったが、未だ完全解決には至っていない。そのため、GFPのように蛍光で容易に検出可能ではないIP3受容体に関しては、その発現の実証を完全にはできていない。現状の打開策としては、E4遺伝子発現のためのプロモーターを、①より弱いものに変えることや、②発現タイミング（早く/遅く）を変えるもの、などへの変更が挙げられよう。本研究から得られた成果を元に、今後は系の改良を引き続き行い、より力価が高いウィルスを得ることが得ることができるようにする予定である。
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[Journal Article] Genotype-Phenotype Correlations of Malignant Hyperthermia and Central Core Disease Mutations in the Central Region of the RYR1 Channel2016
Author(s)
Murayama, T., Kurebayashi, N., Ogawa, H., Yamazawa, T., Oyamada, H., Suzuki, J., Kanemaru, K., Oguchi, K., Iino, M., Sakurai, T.
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Journal Title
Human Mutation
Volume: 37
Pages: 1231-1241
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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