• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2014 Fiscal Year Annual Research Report

光散乱および分光法によるセルロース合成酵素活性の新規定量法の開発

Research Project

Project/Area Number 25650033
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

今井 友也  京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Keywordsセルロース合成酵素 / 酵素活性定量 / アンスロン硫酸法 / 部位特異的変異導入 / 蛍光光度計 / 分光光度計
Outline of Annual Research Achievements

最終年度に行った研究内容は、以下の3つである。
1.濁度測定とセルロース合成量の相関: セルロースは水に不溶性であるため、試験管内でセルロース合成酵素活性を働かせると、反応液が白濁する現象が見られる。この白濁の程度を吸光光度計で濁度として測定した。その結果、反応初期の時間変化測定から得たデータで速度論的解析を行うと、従来の放射性同位元素ラベル化基質を用いた実験と同様の値が得られることが判明した。一方で、従来の方法で観察された結果と異なる点も見られ、濁度測定を合成活性測定に用いるには、まだ解決すべき問題があることが明らかとなった。
2.アンスロン・硫酸法の適用可能条件の精査とその応用: アンスロン・硫酸法を生物試料に応用する際には、最初にセルロースを単離する必要がある。したがって多少の夾雑物が残るセルロース試料について、本反応を行うことになる。そのような夾雑物として、脂質や界面活性剤(SDS)を候補に挙げ、実験を行った。その結果、脂質、SDSとも0.1%程度までなら定量結果に影響を及ぼさないことを示した。なおこの際、前年度までに確立したベースライン補正が有効であることも確認できた。また本法を、最近我々が別途に構築した組換え体セルロース合成酵素の活性再構成系に適用し、各種点変異体の合成活性を調査した。その結果は、2013年、2014年に報告された三次元構造解析から提案された酵素反応機構のモデルを支持する一方、糖転移反応アクセプター基質の結合部位付近で、植物とバクテリアで何らかの異なるメカニズムが使われていることが判明した。
3.蛍光染料を用いたセルロース定量法の開発: 前年度に引き続き、蛍光色素を使った測定方法の改良を試みた。標準試料を使った方法については確認できたが、上述の活性再構成系に適用可能なプロトコルの確立には至らなかった。継続して、実験を進めていく予定である。

  • Research Products

    (6 results)

All 2015 2014

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Functional reconstitution of cellulose synthase in E. coli2014

    • Author(s)
      Tomoya Imai, Shi-jing Sun, Yoshiki Horikawa, Masahisa Wada, Junji Sugiyama
    • Journal Title

      Biomacromolecules

      Volume: 14 Pages: 4206-4213

    • DOI

      10.1021/bm501217g

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] How to produce cellulose into "microfibril"?2015

    • Author(s)
      Tomoya Imai
    • Organizer
      OIST mini-workshop, "Unraveling the mysteries of cellulose"
    • Place of Presentation
      Okinawa OIST
    • Year and Date
      2015-04-21 – 2015-04-22
    • Invited
  • [Presentation] Functional analysis of cellulose synthase by site-directed mutagenesis2015

    • Author(s)
      Shi-jing Sun, Yoshiki Horikawa, Junji Sugiyama, Tomoya Imai
    • Organizer
      International Symposium on Wood Science and Technology 2015
    • Place of Presentation
      東京 船堀タワーホール
    • Year and Date
      2015-03-15 – 2015-03-17
  • [Presentation] 部位特異的変異導入によるセルロース合成酵素の機能解析(II)2014

    • Author(s)
      孫世静、今井友也、杉山淳司
    • Organizer
      第87回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都 国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] Quantification of the cellulose produced by recombinant cellulose synthase in E.coli2014

    • Author(s)
      孫世静、堀川祥生、杉山淳司、今井友也
    • Organizer
      セルロース学会第21回年次大会
    • Place of Presentation
      鹿児島 鹿児島大学
    • Year and Date
      2014-07-17 – 2014-07-18
  • [Presentation] セルロース合成酵素の大腸菌内機能再構成2014

    • Author(s)
      今井友也、孫世静、堀川祥生、和田昌久杉山淳司
    • Organizer
      セルロース学会第21回年次大会
    • Place of Presentation
      鹿児島 鹿児島大学
    • Year and Date
      2014-07-17 – 2014-07-18

URL: 

Published: 2016-06-01  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi