2014 Fiscal Year Annual Research Report
光散乱および分光法によるセルロース合成酵素活性の新規定量法の開発
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25650033
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | セルロース合成酵素 / 酵素活性定量 / アンスロン硫酸法 / 部位特異的変異導入 / 蛍光光度計 / 分光光度計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最終年度に行った研究内容は、以下の3つである。
１．濁度測定とセルロース合成量の相関： セルロースは水に不溶性であるため、試験管内でセルロース合成酵素活性を働かせると、反応液が白濁する現象が見られる。この白濁の程度を吸光光度計で濁度として測定した。その結果、反応初期の時間変化測定から得たデータで速度論的解析を行うと、従来の放射性同位元素ラベル化基質を用いた実験と同様の値が得られることが判明した。一方で、従来の方法で観察された結果と異なる点も見られ、濁度測定を合成活性測定に用いるには、まだ解決すべき問題があることが明らかとなった。
２．アンスロン・硫酸法の適用可能条件の精査とその応用： アンスロン・硫酸法を生物試料に応用する際には、最初にセルロースを単離する必要がある。したがって多少の夾雑物が残るセルロース試料について、本反応を行うことになる。そのような夾雑物として、脂質や界面活性剤（SDS）を候補に挙げ、実験を行った。その結果、脂質、SDSとも0.1%程度までなら定量結果に影響を及ぼさないことを示した。なおこの際、前年度までに確立したベースライン補正が有効であることも確認できた。また本法を、最近我々が別途に構築した組換え体セルロース合成酵素の活性再構成系に適用し、各種点変異体の合成活性を調査した。その結果は、2013年、2014年に報告された三次元構造解析から提案された酵素反応機構のモデルを支持する一方、糖転移反応アクセプター基質の結合部位付近で、植物とバクテリアで何らかの異なるメカニズムが使われていることが判明した。
３．蛍光染料を用いたセルロース定量法の開発： 前年度に引き続き、蛍光色素を使った測定方法の改良を試みた。標準試料を使った方法については確認できたが、上述の活性再構成系に適用可能なプロトコルの確立には至らなかった。継続して、実験を進めていく予定である。
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