2014 Fiscal Year Research-status Report
プロサイモシンαの核シャトルによるレシピエント細胞リプログラミング機構解明
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25650036
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
松永 隼人 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (20437833)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DAMPs / 生理活性物質 / 受容体 / 核シャトル / 脳・神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ストレス誘発性に核から細胞外に遊離する脳保護性のプロサイモシンα（ProTα）の作用機構解明を目的とした研究である。その特徴として、遊離する神経細胞をホスト細胞と位置づけ、レシピエント細胞への作用機構には受容体シグナリングと核内への再取り込み：核シャトル機構が存在するという点がある。本研究では、「核シャトルしたProTαは、レシピエント細胞の表現型をシンクロさせる力の因子である」と仮説を立て、その検証を行う。
１．細胞膜候補受容体TLR4/MD2との結合：前年度、ミクログリア細胞に対してProTαは、受容体シグナリングを介して作用することを明らかとし、また、そのシグナルが自然免疫受容体（TLR4/MD2)-インターフェロン系であることを明らかとしていた。本年度は、リガンドProTαと受容体TLR4/MD2との相互作用をバイオセンサーであるQCMで動力学的に計測すると共に、in silico解析にてその相互作用様式の予測を行った。
２．ProTαの新規細胞膜受容体同定：これまでにProTαの神経細胞死保護効果は、Gαi共役受容体シグナルを介する事を明らかとしている。これを受けて、Gαiを含む細胞膜の構成体であるLipid Raftを精製し、その画分からProTαと結合する分子の同定に成功した。さらに、組換えタンパク質受容体との相互作用解析、受容体阻害実験によるProTαの神経保護効果消失も確認している。
平成27年度は、ProTαの細胞表現型制御としてレシピエント細胞における遺伝子発現変化の網羅的解析と核内にシャトルしたProTαによって直接的に遺伝子発現変動制御を受ける分子の同定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．ProTαが核シャトルするレシピエント細胞としてC6グリオーマ細胞の解析を当初行う予定であったが、本細胞における核シャトルのステップは細胞ストレス依存的であり、ストレス誘発性の遺伝子発現が予測され、実験系の複雑化による結果解釈が妥当でなくなる可能性が生じた。よって、ストレス非依存的に核シャトルが起こる細胞を探索する必要があり、既に実験に適した細胞を同定済みである。
２．神経細胞、ミクログリアの受容体シグナリングが神経保護の主要径路であること、核シャトル機構との差別化を行う必要性から「核シャトル機構」よりも優先的に「受容体シグナリング機構」を解析する必要があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
核シャトル可能なProTαリコンビナントの作製と、ストレスに依存することなく核シャトルするレシピエント細胞の特定、そして、細胞膜受容体を介したProTαシグナリングの概要が判明したことから、今後は、細胞表現型を制御するエピゲノム性遺伝子発現制御機構の変換解析を行う。網羅的に発現変動遺伝子を解析し、特に、神経栄養因子群や生存サイトカインの発現状態に着目する。既に、直接的に核内シャトルされたProTαがヒストンと結合することを明らかとしているが、どの遺伝子を内包するヌクレオソームなのかをシャトルしたProTαを利用したChIP-Seqを行い同定する。これにより、第一に核シャトルしたProTαのエピゲノム性制御を明らかとすることで「直接的な核内情報伝達駆動の分子機構」が提示できると考える。第二に、DAMPsの新たな機構として分類可能であると考える。第三に、本機構の生物学的意義として、「対細胞ストレス戦略として、核タンパク質が細胞核間を伝播し、細胞形質を自己保護に向けて制御する」との仮説を証明できる。将来的に、ProTαのリプログラミング機構を模倣する化合物の創製は、脳梗塞といった脳神経系疾患のみならず、細胞外ProTα活性が確認されている免疫系の疾患にも寄与する可能性を有し、エピゲノム創薬に繋がる高い可能性を有する。
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| Causes of Carryover |
病気療養により事業を執行する期間が短縮されたため、補助事業期間の延長を申請したことによる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
リプログラミング細胞における発現遺伝子の同定と変動レベル解析のためのマイクロアレイ解析試薬の購入等に使用する。また、核シャトルプロサイモシンαによって直接的に発現変動する遺伝子の同定のための次世代シーケンサー解析試薬の購入等に使用する。
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