2014 Fiscal Year Research-status Report
新規細胞選別技術による細胞間コミュニケーションの解析
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25650058
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
寺薗 英之 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (30398143)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 神経ネットワーク / 一細胞回収技術 / アプタマー / マイクロ加工技術 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き､細胞表面結合性アプタマーを作製する事を目標とした。Cell-SELEX法を独自に改良したアプタマー選別法を用いて細胞表面に結合するアプタマーの精製を行った。その結果、本手法はターゲットとなる細胞はより多くの細胞数で行わないとノイズ成分が多く特定のDNAアプタマーを選別できないことを明らかにした。そこで、対象を少数でしか確保できない初代海馬神経細胞ではなく簡便に細胞数が確保できる細胞株HUVEC細胞に変更し、引き続きCell-SELEXを行った。前回同様に次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析した。バイオインフォマティクスを用いた解析の結果、大腸菌でのサブクローニングではわからなかったSELEXならではの特徴を見いだすことができた。本結果より単純に高頻度に出現する配列が結合しやすい配列ではないことを明らかにした。本結果を用いて現在アプタマーの選定を行っている。
また、計画書に記載している「形態学的・電気生理学的な特徴を同定した一細胞回収技術の開発」も高分子のアルギン酸を用いて研究を進めている。神経細胞の細胞外電位を測定できる多電極アレイディッシュ上にアルギン酸のゲルを5um程度の厚みで薄く層を作り、細胞接着基質をコートすることにより、アルギン酸上での神経活動の検出に成功した。アルギン酸シートはキレート剤であるEDTAを加える事により容易にゾルかする事に成功している。そこで、多電極ーアルギン酸シート上に配置した神経細胞を回収できるか検討した結果、トリプシンなどの侵襲性の高い試薬を使うことなく回収する事に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の目標として、一細胞回収技術の応用として多電極アレイディッシュ上にアルギン酸を加工して、電位計測しながらもEDTAによる細胞回収できるかどうかの検討を行った結果、うまく両立させる技術の開発に成功した。また、細胞表面アプタマーの精製に関しては次世代シークエンスの結果から、当初計画していた対象の神経細胞から細胞株であるHUVEC細胞に移行したが、次世代シークエンス結果より手法自体の確立に向けて前進できる結果を出すことできた。
そのため、当初予定している計画におおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き細胞表面アプタマーの作製について検討を進め、特異的に結合できるアプタマーを簡便に決定できる手法の確立に向けて研究を進める。また、アルギン酸を用いた細胞形態や細胞外電位を指標とした細胞選択法により、特定の細胞を選択し、神経細胞のパターニングを試みる。様々なパターンを作り出すことにより、様々なパターンをにより特定の発火パターンを示すかどうか検討を進める。また、アプタマーによる細胞選別以外にも特定の細胞を選ぶ、例えばRNAイメージングや、遺伝子導入動物を用いてより特定の細胞を選択し、それにより細胞パターニングを行う事で神経細胞同士が行う細胞間コミュニケーションの理解を目指す。
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