2013 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリア遺伝子を完全核移行させた真核生物の創成
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25650067
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡本 浩二 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (40455217)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / ミトコンドリアDNA / 酵母 / 合成生物学 / オミックス |
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| Research Abstract |
本研究では、出芽酵母のミトコンドリアゲノムにコードされた呼吸鎖関連の遺伝子全てを核内の染色体へ組み込み、細胞質で合成したタンパク質をミトコンドリアへ輸送するシステムを構築して、ミトコンドリアゲノムを持たずに呼吸増殖する「ミトコンドリア・ゲノムレス細胞」を創成する。加えて、この改変細胞をオミックスの手法を用いて解析し、ミトコンドリアゲノムの酸化損傷のリスクから解き放たれた細胞が獲得する性質を解明する。
上記の目的を達成するために、平成25年度においては、（１）核ゲノムの使用コドンに改変させた遺伝子に選択マーカー・関連核遺伝子の転写調節配列・ミトコンドリア輸送および仕分けシグナルを付加した「合成カセット」を設計し、人工遺伝子合成にてクローニング、（２）形質転換により合成カセットを核ゲノムへ挿入、（３）得られた酵母株のミトコンドリアDNAを変異剤処理により完全に欠損させて、ミトコンドリア・ゲノムレス細胞を作製、の３段階の達成を目指した。まず、（１）の人工遺伝子合成によるクローニングについて、検討と改良を行なった。一般に、同じ塩基配列からなるコドンが連続したり、AGCTの塩基組成に偏りがあると、DNA合成装置での遺伝子作製がうまくいかないことがある。この問題を克服するため、繰り返し配列部分のコドンの塩基配列を可能な範囲で多様化し、コドンを変更すること無くGやCで置換するなどの改変を大胆に加えた。その結果、目的の遺伝子DNAを合成することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成25年度に想定した研究目的の達成度については、当初の計画よりもやや遅れていると評価している。これは、人工合成によって作製する予定であった遺伝子に繰り返し配列が多く存在し、また酵母のミトコンドリアDNAの塩基組成はA-Tに富んでいるために、遺伝子DNA配列の組成が極端に偏る領域があり、その部分の合成が困難であったからである。とりわけ、数百塩基対を超えるような長鎖のDNAは合成効率が落ちる傾向が知られている。一方、コドンの読み取り、すなわち翻訳効率は塩基配列の違いによっても影響を受ける。また、ミトコンドリアと細胞質の転写・翻訳系のコドン・プリファレンスはかなり異なる。人工合成した遺伝子は細胞質マシナリーで発現するため、翻訳効率を最大にするような改変も必要ではないかと考えた。そこで、出芽酵母における既存のコドン・プリファレンス表を参考にして、塩基配列の繰り返しや塩基組成の偏りを避けつつ、可能な範囲での最適化を行なった。さらに、目的の遺伝子産物は複数の膜貫通ドメインをもつ疎水性の高いタンパク質である。細胞質で翻訳されたポリペプチドは親水性環境におかれており、ミトコンドリアの外膜と内膜を透過する際のタンパク質輸送チャネルの内側もまた、親水性の表面でできている。そこで、親水性環境を介したミトコンドリアへの輸送が阻害されることなく、かつ最終目的地であるミトコンドリア内膜へ正常に組み込まれるよう、膜貫通ドメインのアミノ酸組成にも改変を加えた。これらの工夫により、目的の遺伝子産物を適切に発現・局在させることができるようになると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度においては、昨年度における遅れを取り戻し、最終目的の達成を目指して計画を実行してゆく。すなわち、（２）形質転換により合成カセットを核ゲノムへ挿入、（３）得られた酵母株のミトコンドリアDNAを変異剤処理により完全に欠損させて、ミトコンドリア・ゲノムレス細胞を作製、を完了する。次に、下記の解析を進めてゆく。
（４）改変細胞のミトコンドリアの構造・機能の解析：上記で得られた細胞について、ミトコンドリアの膜構造を電子顕微鏡で解析する。呼吸機能については、単離ミトコンドリアの生化学的解析により、呼吸鎖の安定性・酸素消費量を調べる。
（５）改変細胞の表現型解析：野生型および改変細胞を発酵性培地で増殖させ、呼吸欠損で生じるプチコロニーの出現頻度を調べる（通常、1-5%の割合でmtDNA変異によるプチコロニーが出現する）。また、経時寿命（静止期の生存率）と複製寿命（母細胞の分裂回数）を調べるとともに、呼吸欠損頻度を解析し、ミトコンドリアの恒常性を野生型と改変細胞で比較する。
（６）改変細胞の獲得形質のトライオーム解析：野生型および改変細胞の全転写産物のプロファイリング（次世代シーケンサーによる比較定量解析法）・全タンパク質の相対定量（細胞培養液中のアミノ酸を用いた安定同位体標識法）・約900の主要代謝物質の相対定量（キャピラリー電気泳動時間飛行型質量分析法）を行い、ミトコンドリア遺伝子の核コード化がもたらす変化を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度の実験計画の最初のステップである人工遺伝子合成において、時間を要する結果となった。これは、作製予定の遺伝子に繰り返し配列が多く存在し、なおかつDNAの塩基組成はA-Tに富んでいるために、DNA配列の組成が極端に偏る部分があり、合成が困難であったからである。目的の遺伝子が数百塩基対を超える長鎖DNAであったことも、合成効率を下げる原因となった。以上の理由により、その次のステップの実験計画に要する費用分が未使用となり、本年度に繰越することとなった。また、人工遺伝子合成に必要なコストの一部は、当該年度に使用が限られている運営費交付金を用いたため、繰越額も200万円というまとまった金額となっている。
繰越分の使用計画においては、昨年度に達成できなかった実験の費用として使用してゆく。具体的には、②人工遺伝子合成したカセットをプラスミドにクローニングし、目的タンパク質の変異細胞に導入、細胞の呼吸活性を非発酵性培地での増殖にて検証する。③ミトコンドリア機能が回復しない場合は、PCRを用いたランダム変異導入を行い、変異細胞の呼吸不全を相補する改変カセットをスクリーニングする。④上記の発現カセットを核ゲノムへ挿入するため、染色体上の標的配列を含む挿入カセットをPCRで増幅する。⑤挿入カセットで目的タンパク質の変異細胞を形質転換する。⑥ミトコンドリア遺伝子の核コード化を完了した後、薬剤処理によりミトコンドリアDNAを完全に欠損させる。
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Research Products
(6 results)
