新たな蛋白質間相互作用の発見を目指す共局在オーム解析法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25650068
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 木俣 行雄 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (60263448)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: タンパク質局在

Research Abstract

出芽酵母では１９９０年代に全ゲノム配列の解読が終了しており、約６０００個のＯＦＲがタンパク質をコードするであろうと予測されている。そして、それらのＯＲＦにＧＦＰタグを挿入し、それぞれのタンパク質の局在を網羅的に調べるというプロジェクトも進められている（Huh et al., “Global analysis of protein localization in budding yeast.” Nature Vol.425 686-691 (2003)）。よって、多くのタンパク質の局在はいちおうは決定されているものの、例えば特定のオルガネラ（あるいはサイトゾル）に局在するが「ムラ」があるタンパク質、あるいは、実体が全く不明な部位に局在するタンパク質も数多いことが分かっている。本研究では、任意の２つのタンパク質の局在を網羅的に検討することを目指す「共局在オーム」解析の確立を目指す。それによって、新しい細胞内区画を発見でき、さらには、タンパク質相互作用を見つけ出すことができると期待している。そこで本研究ではまず、汎用性の高いDNAコンストラクトを用いた遺伝子置換法によって、GFPタグ付きORF株のGFPタグをmCherryタグへと置換する手法を作り上げる必要がある。それが完成したら次に、数多くのGFPタグ付きORF株のGFPタグをmCherryタグへと置換し、菌株の交配により異なるOFRがそれぞれGFPタグとmCherryタグ標識された株を作り出すことが可能となる。当該年度においては、GFPタグ付きORFをmCherryタグへと置換するDNAコンストラクトを作製することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GFPタグをmCherryタグに置換するDNAコンストラクトの作製において、当初に設計したものが期待通りに機能しなかった（ゲノムへの導入効率が低かった）。よって、新しいDNAコンストラクト複数個、設計および作製する必要があり、当初の計画よりも研究の進行が遅れることとなった。また、GFPタグ付きORF株の蛍光像をあらかじめ多数観察しておく計画であったが、それに用いる高解像度顕微鏡が研究期間に納入されるのが遅く（2013年12月）、これも研究が遅れる要因となった。

Strategy for Future Research Activity

当該年度に作製したDNAコンストラクトを用い、小胞体局在とされている約２００種類のタンパク質について、共局在オーム解析を進めたい。具体的には、まず、GFPタグ付きORF株（小胞体局在タンパク質にGFPタグがついたものを発現している）のGFPタグをmCherryタグに置換する。そして、GFPタグ付きORF株とmCherryタグ付きORF株を交配後に減数分裂に供し、異なるOFRがそれぞれGFPタグとmCherryタグ標識された株が取得でき次第、順次、高解像度顕微鏡にて観察に供したい。