2013 Fiscal Year Research-status Report
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25650082
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
太田 訓正 熊本大学, 生命科学研究部, 准教授 (90244128)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 乳酸菌 / 細胞 / リプログラム |
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| Research Abstract |
乳酸菌は糖を分解して乳酸を生成する細菌類の総称であり、自然界に広く分布し、ヒトの腸内では善玉菌として健康の維持に働く。申請者はヒト皮膚細胞に乳酸菌を取り込ませると、アルカリホスファターゼ染色陽性の細胞塊が形成され、リプログラミングの誘導が起こり、３胚葉由来の細胞に分化できる多能性細胞が作製できることを見出した（Ohta et al., PLOS ONE 2012）。本申請では、Human Dermal Fibeoblasts（HDF細胞）を培養したシャーレに乳酸菌を添加後、数日で結果が判明する細胞塊形成活性を指標にしながら、生化学的手法および網羅的解析法を組み合わせ、リプログラミングを誘導する物質（Factor X）を同定することを目的とした。
研究材料が乳酸菌であることから、大量培養が低コスト・短時間で可能である。まず、乳酸菌を超音波破砕処理し、硫安沈殿後、フィルターをとおしてHDF細胞を用いて細胞塊形成能を調べたところ、効率よく細胞塊が形成された。次に、クロマトグラフィー（FPLC）を用いた粗精製を試みた。イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを数回繰り返し、限外ろ過を組み合わせ、細胞塊形成能を持つ分画を同定した。その分画を用いて、SDS-PAGEを行い、クマシーブルー染色を行ったところ、１０数本のバンドが認識されたため、これらを用いてMALDI-TOF-MS解析をを行った。同定されたタンパク質の中には、リプログラミングを誘導する物質（Factor X）が存在することが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
乳酸菌から、細胞塊形成能を持つ分画を同定し、その中には目的とするリプログラミングを誘導する物質（Factor X）候補が存在することが期待されるから。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補タンパク質と考えられるものについては、タンパク質を精製し、HDF細胞を用いて細胞塊形成能を調べ、最終敵には乳酸菌由来リプログラミング因子の同定を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
乳酸菌を大量培養し、超音波破砕した分画を用いていくつかのクロマトグラフィーを行う予定であったが、初めての実験であったため、計画どおり分画を準備できなかった。また、タンパク質精製に用いる機器が共通機器であったため、予約をとることができなかった。
実験手法を確立できたため、時間的なロスは無くなると言える。翌年分として請求した研究費は、リプログラミング候補因子のタンパク質精製用のカラムや試薬購入に用いる。
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