2014 Fiscal Year Research-status Report
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25650083
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
岡本 龍史 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (50285095)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 受精 / 核融合 / 受精卵 / シンシチウム / 核の合一 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多細胞真核生物を構成するほとんどの細胞では1細胞1核の状態が保たれているが、1個の細胞中に複数の核が存在する細胞として、合胞体（シンシチウム）と雌雄配偶子が融合した直後の受精卵がある。合胞体は、植物の胚のうや胚乳、昆虫の初期胚、動物の骨格筋繊維や胚盤などの形成期に生じるが、細胞内の核が融合することはない。一方、受精卵中では、受精直後には精核と卵核の２つの核が存在するが、それらは速やかに融合し、受精卵核を形成する。このように、1個の細胞内で複数の核が存在するという点では合胞体と受精卵は共通しているが、前者では核が融合しない状態で安定しているのに対して、後者では両核の融合が速やかに進行するという明確な違いがある。本研究は、卵細胞、精細胞、体細胞などを様々な組み合わせで融合させた細胞中の核の動態を詳細に観察・解析することで、核融合を制御する機構の一端を明らかにすることを目的とした。
本研究により、イネ雌雄配偶子の融合細胞（受精卵）内では、精核がアクチンフィラメントを介して卵核へと移動し、両核が近接すると、卵核クロマチンが精核内部へ侵入することで精核の体積が増加し、その後、核融合の進行に伴って精核クロマチンが脱凝集して核の合一が完了することが明らかにされた。さらに、受精卵ゲノム由来の新規遺伝子発現は核合一の終期以降に誘導されること、および精細胞由来の転写産物が融合直後の融合卵において翻訳されている可能性も示された。また、卵細胞内全域に広がったアクチンメッシュが卵核方向へと移動・集約することで精核が移動していることが示唆された。これに加え、体細胞と雌雄配偶子を任意の組み合わせで融合させたのち、それら融合細胞内における核融合過程を解析したところ、卵細胞内には「核融合因子」が存在し、その働きを促進させる「核融合促進因子」が精細胞側に存在する可能性が強く示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請課題は、卵細胞、精細胞、体細胞などを様々な組み合わせで融合させた細胞中の核の動態を詳細に観察・解析することで、植物における核融合の制御機構を司る分子基盤の一端を明らかにすることを目的としている。
本研究により、精細胞核はアクチン繊維依存的に卵細胞核と接するようになり、その後、精細胞核内で凝集していた染色糸が融合核内に拡散していく様子（核融合の進行）が観察された。さらに、受精卵核内において精細胞核染色糸の脱凝集が起きる前に、卵細胞核染色糸が精細胞核内に侵入して精細胞核の肥大化が起こることが明らかになった。次に、雌雄配偶子核の合一以外の核融合過程を観察するため、体細胞と雌雄配偶子、雌性配偶子同士などを様々な組み合わせで融合させ、それら融合細胞内における核動態を観察した。その結果、受精卵内では、融合後4時間以内に核の合一が完了するが、2つの卵細胞を融合させた細胞内においても、約20時間後には2つの卵核が合一した。さらに、卵細胞同士を融合させた細胞にさらに精細胞を融合させると、核合一の進行が速くなり、約12時間で融合細胞内の3つの核が1つに合一した。また、葉プロトプラスト同士の融合細胞を用いた予備的な実験において、融合後24時間までの観察内では核合一が見られなかった。これら結果は、卵細胞が精核以外の核とも核合一を行う機構を保持し、かつ、精細胞の融合により核合一の進行が促進されることを強く示唆しており、雌雄配偶子内に核の合一を制御する因子が存在することを示唆している。これに加え、イネ卵細胞および受精卵への物質導入系の確立を試みた結果、卵細胞・受精卵を低融点アガロースゲル中に包埋・固定し、かつ、レーザーインジェクション法を用いることで、導入効率を約100％とすることに成功した。この手法は、核融合制御因子の同定に向けた有力な実験系となると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
精細胞内に存在が推定される核融合促進因子の同定に向けた解析を進める。卵細胞はヒストンH2B-GFPで細胞核が蛍光標識されている形質転換イネ由来のものを、精細胞（花粉）は野性型イネ由来のものを用いる。イネ花粉をマンニトール溶液内でバーストさせたのち、パーコール密度遠心勾配法により精細胞を大量調製する。次に精細胞を軽く破砕したのちに、ショ糖密度勾配法により核、細胞質、各種オルガネラの各画分を分画する。それぞれの画分を、レーザーマイクロインジェクション法により、卵細胞同士を融合させた細胞へ導入したのち、融合細胞中の核融合の進行の速度を蛍光タイムラプス観察により検定する。核融合促進効果が見られない際は、全画分の同時導入も試みる。また、LMI法ではなく、リポソームインフェクションなどの他の物質導入法による融合細胞への物質導入も試みる。核融合促進活性が検出された際は、精細胞の細胞質、核、各種オルガネラのいずれの画分に核融合制御関連分子が存在するのかを明らかにするとともに、核融合の促進活性を示した画分（細胞質画分、核画分、あるいは各種オルガネラ画分）をさらに、タンパク質画分、低分子物質画分、RNA画分に分け、どの画分に核融合促進活性が含まれているのかを明らかにする。その後さらに物質分画を進め、上記と同様の解析を進めることで、核融合制御関連分子の同定を試みる。また、次世代シークエンス解析により卵細胞および精細胞のトランスクリプトーム解析を行うことで、既知の核融合関連因子をコードする遺伝子群の配偶子における発現レベルを明らかにし、それら因子の配偶子核融合への関与についても検討を進める。
上記に加えて、核融合機構の分子基盤解明に向け、各種マーカーラインや変異体ストックが豊富なシロイヌナズナの配偶子を用いたin vitro受精系の確立に向けた研究も付せて進める。
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| Causes of Carryover |
融合細胞の蛍光観察などの顕微鏡下での観察作業が大幅に増えると予想されたので、平成26年度に蛍光装置あるいは高性能レンズの購入を予定していたが、観察作業の多くがアクチン微繊維を対象としたものであったため、共焦点レーザー顕微鏡（専攻の共通機器）を用いた解析を主に行ったことから、当該年度での当該装置・レンズの購入を見送った。この蛍光装置・高性能レンズについては、蛍光顕微鏡上での細胞の微細操作および観察作業が増える平成27年度に購入することにしたので次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
核融合促進因子の活性測定およびその同定の実験ステップに進む平成27年度は、融合細胞の蛍光観察など、顕微鏡下での操作・観察の作業が大幅に増える。このことから、翌年度分として請求した助成金での消耗品の購入に加えて、顕微鏡用の蛍光装置または高性能レンズの購入を予定している。また、配偶子細胞などの次世代シークエンス解析も予定している。
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