2013 Fiscal Year Research-status Report
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25650100
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
古谷 将彦 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (10432593)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 配偶子効果 / 初期胚 / RNA結合タンパク質 |
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| Research Abstract |
平成２５年度は初期胚の軸形成に重要な働きをするAtMAGOの機能解析と配偶子効果遺伝子の網羅的探索に向けた予備実験を行った。まずAtMAGOの機能解析では、AtMAGO遺伝子の発現領域の特定を行った。AtMAGOプロモーター制御化で、GUSおよび核にターゲットしたGFPを発現させたところ、雌性および雄性配偶体で発現することを見いだした。また、受精卵および初期胚においても発現が確認された。つぎに、AtMAGOタンパク質の細胞内局在を調べるために、ヒトMAGO抗体を用いた免疫染色およびAtMAGO-GFP融合遺伝子を自身のプロモーター制御下で発現させノックアウト変異体に形質転換を行った。免疫染色では体細胞において核局在が確認できたが、配偶体および受精卵では固定がうまくいかず確認できていない。今後固定法を検討する予定である。GFP融合タンパク質については、現在相補性の確認中である。ノックアウト変異体が非常に強い表現型を示し多くが配偶体致死を示すため、弱いアレルの作成を行った。ショウジョウバエにおいて報告されている４種の変異をAtMAGO遺伝子にそれぞれ導入しノックアウト変異体に形質転換したところ、初期胚の発生に重篤な異常を生じるが致死性を示さない系統が得られた。今後のこの弱い変異アレル系統を用いて表現型解析を行う。つぎに、配偶子効果遺伝子の探索に向け、各配偶子および受精卵特異的マーカーの作成を行った。各配偶子に特異的に発現する遺伝子のプロモーターを単離し、現在レポーター遺伝子に連結させている。受精卵特異的マーカーの作成に使用する予定であったシステムがうまく働かず、現在新たなシステムの構築を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度に計画していたAtMAGOの機能解析と配偶子効果遺伝子の探索に向けた予備実験を実施し、おおむね良好な結果を得ている。AtMAGOの機能解析のいくつかの実験は現在解析中のものがあるが、まもなく結果が得られるものであり、問題なく進展している。そして、配偶子効果遺伝子の探索に向けた予備実験では、受精卵特異的マーカーの作成に手こずってはいるが、現在新たなシステムの導入に向けて動き出したところである。平成２６年度に持ち越しとはなったが、その他の各配偶子特異的マーカーの作成は問題なく進展しており、全体としておおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
AtMAGOの機能解析では、ターゲットRNAの探索を行うと同時に、候補RNAであり初期胚発生に関与することが報告されているSSPに着目しAtMAGOとSSPの関係を明らかにしていく。ターゲットRNAの探索には、作成途中のAtMAGO-GFP融合タンパク質を発現する形質転換体を用いる。GFP抗体をもちいてRNA共免疫沈降を行い、AtMAGOと結合するRNAの網羅的探索を行う。一方、SSPとの関係を調べるため、SSP mRNAの可視化実験を行う。SSP mRNAを蛍光標識しマイクロインジェクションにより卵細胞に導入したり、RNA結合タンパク質PumilioをSSP mRNAに結合できるように改変し蛍光タンパク質と融合させることでSSP mRNAを間接的に可視化することを目指す。これらの技術を用いてatmago変異体の受精卵におけるSSP mRNAの分布を解析する。また、SSPタンパク質の局在解析も同時に進め、同じようにatmago変異体におけるSSPの局在化におけるAtMAGOの機能を明らかにする。
配偶子効果遺伝子の探索実験においては、まず平成２５年度からの持ち越し実験（受精卵特異的マーカーの作成）を早急に実施する。そして、それぞれの配偶子特異的マーカーおよび受精卵特異的マーカーを用いて、各細胞を回収する技術を確立する。現在のところ、フローサイトメトリーを用いる予定である。
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