in vivoで体細胞から生殖細胞をつくる

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25650110
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 小林 亨 静岡県立大学, 付置研究所, 教授 (30221972)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 生殖細胞 / 体細胞 / 初期化 / イモリ

Research Abstract

25年度は、以下の項目について研究を実施した：
(1) 生殖細胞分化の分子マーカー遺伝子の単離、及びそれに対する特異抗体の作製
(2) イモリ精巣組織索状部の柱状上皮細胞の生殖細胞への転換誘起
(1)に関しては、生殖細胞に特異的に発現する遺伝子としてnanos、vasa cDNAをクローニングした。vasaに関しては、配列を基に合成したペプチドを抗原として抗体の作製を行った。cDNAから作成したリコンビナントタンパク、様々な組織から抽出したタンパクサンプルを用いたイムノブロットおよび免疫組織化学の結果から、本抗体は、vasaタンパクを特異的に認識し、かつ生殖細胞に特異的に発現することが明らかとなった。これにより、既に保有している生殖細胞を特異的に認識できるSGSA-1抗体とともに本研究課題の解析に使用可能となった。イモリ精巣組織におけるvasa発現部位を免疫組織化学法により検討した結果、精原細胞、精母細胞でその発現はみられた。一方、索状部においては、間質部に局在する幹細胞型生殖細胞は、vasa 陽性であったが、柱状上皮細胞はvasa 陰性であった。
(2)に関しては、主要な精子形成細胞のステージが異なる３の時期のイモリを用いて、それぞれ、索状部以外の精巣組織を除去を行った後、エストロゲン（estradiol benzoate)の投与を4ヶ月間、行った。既に投与が終了した実験では、索上部柱状上皮細胞の形態変化が認められた。現在、vasa、SGSA-1抗体を用いた解析及び、電子顕微鏡を用いて柱状上皮細胞の特性について解析を開始している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

25年度の実施計画（・生殖細胞分化の分子マーカー遺伝子の単離、及びそれに対する特異抗体の作製、・イモリ精巣組織索状部の柱状上皮細胞の生殖細胞への転換誘起）については、以下のことが達成された：
1. mRNA、タンパクレベルで使用可能な生殖細胞に特異的に発現するマーカー分子が得られた。
2. 精巣組織の部分的除去及びエストロゲン投与によって期待される形態変化が誘導できた。

Strategy for Future Research Activity

「イモリ精巣組織索状部の柱状上皮細胞の生殖細胞への転換誘起」に関しては、これまでに索状部以外の精巣組織の除去を行った後、長期間のエストロゲン（estradiol benzoate) 投与を行なった。現在間、既に投与が終了した実験では、索上部柱状上皮細胞の形態変化が認められた。今後、生殖細胞に特異的に発現するマーカー分子である vasa、SGSA-1抗体を用いた解析及び、電子顕微鏡を用いた柱状上皮細胞の特性について解析を進め、人為的誘導により、柱状上皮が生殖細胞としての性質を有するようになるのか否か、を明らかにする。また、経時的変化についても同様な解析に加えて、q-PCRを用いた解析を行い、柱状上皮細胞の動態について明らかにしていく予定である。