2013 Fiscal Year Research-status Report
睡眠による記憶固定化メカニズム解明に向けたショウジョウバエによる新規アプローチ
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25650116
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
坂井 貴臣 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (50322730)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上野 耕平 公益財団法人東京都医学総合研究所, 運動・感覚システム研究分野, 研究員 (40332556)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 長期記憶 / 睡眠 / 記憶固定化 / period / LNds |
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| Research Abstract |
「睡眠による記憶固定化」は学習後の睡眠によって長期間持続する記憶として定着する現象だが，そのメカニズムは不明である。本研究は，睡眠による記憶固定化のメカニズム解明に向けて，ショウジョウバエ（以下，ハエ）を用いた新規アプローチの確立を目指した。時計遺伝子period (per) は概日リズム形成に必須であるが，長期記憶形成にも必須である。ハエ成虫脳の扇状体と呼ばれる脳領域の一部でGAL4が発現する系統 （OK348および drl[PGAL8]）とUAS-perのF1個体ではGAL4発現細胞でperが過剰に発現して長期記憶が促進する。PER抗体を用いた免疫染色の結果，OK348およびdrl[PGAL8]は，いずれもdorsal latera neurons (LNds)という6個の細胞集団と，ventral lateral neurons (LNvs)と呼ばれる概日時計ニューロンの一部でGAL4が発現していることを明らかにした。RNA干渉法を用いてOK348ポジティブなニューロンでper遺伝子の発現抑制を行うと長期記憶は形成されず，かつ，睡眠量が減少する。しかし，概日時計ニューロン(LNvs) 特異的にper遺伝子発現を抑制しても長期記憶や睡眠に特段の異常が認められなかった。以上の結果から，LNdsのいずれかのニューロンがper遺伝子発現依存的な長期記憶形成と睡眠の制御に関与している可能性が考えられた。そこで，LNdsで発現し，かつ，LNvsで発現しない新たなGAL4系統を探索した。33系統のGAL4系統を用いてPER抗体による免疫染色を行ったところ，LNdsの一部の細胞でGAL4が発現している17系統を見出した。また，これら17系統のうち，LNvsでのGAL4の発現が確認されない系統を同定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
先行研究において，OK348およびdrl[PGAL8]という２つのGAL4系統に関しては， per遺伝子の過剰発現により長期記憶が促進されることから，この2つのGAL4系統のPER発現ニューロンを同定し，共通して発現している細胞を同定することを目的として研究を開始した。その結果，dorsal latera neurons (LNds)とventral lateral neurons (LNvs)という2つの神経集団を同定するにいたった。per遺伝子やその遺伝子産物の脳内発現ニューロンは詳細に同定されており，LNdsやLNvsで発現していることがすでに報告されている。LNvsは概日リズムのペースメーカーとして機能している。しかし，LNdsの役割はよく分かっていない。したがって，記憶や睡眠の制御にかかわるPER発現ニューロンがLNvsなのか，それともLNdsなのかを明らかにする必要が生じた。LNvs特異的に発現するGAL4系統はすでに報告されており利用可能である。RNA干渉法によりLNvs特異的にper遺伝子発現を抑制しても長期記憶に影響が見られなかった。一方，LNds特異的かつLNvsでは発現しないGAL4系統は報告されていなかったため，そのようなGAL4系統の探索を行った。Enhancer trap GAL4系統, promoter-GAL4系統, Janelia Farm GAL4系統を含む33系統について解析し，最終的に目的のGAL4系統の同定に成功したため，今後数個のニューロンレベルまで絞り込むことが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から，LNdsで発現しLNvsで発現しないGAL4系統（Janelia GAL4）を利用できるようになった。LNdsは6個のPERポジティブな細胞で構成されている。LNdsの6個の細胞の内，OK348系統では1個，Janelia GAL4系統では2個の細胞でGAL4が発現していることを確認した。OK348系統で確認されたLNdとJanelia GAL4系統で確認されたLNdsは同じ細胞を含んでいるのだろうか？この疑問を解明するため，ショウジョウバエの２つの遺伝子発現システム（GAL4/UASおよびLexA/LexAop）を組み合わせて利用する予定である。Janelia GAL4と同じgenomic fragmentを用いたJanelia LexA系統が利用可能である。そこで，OK348ポジティブな細胞をGFPで，また，Janelia LexAポジティブな細胞をRFPで可視化することにより，OK348系統のLNdとJanelia LexAのLNdsが同一の細胞を含むかどうかを詳細に検証する予定である。また，Janelia GAL4系統とRNA干渉法を組み合わせ，LNds特異的なper遺伝子発現抑制により長期記憶や睡眠にどのような影響が見られるかを検証する。また，per遺伝子のPASドメイン（二量体形成に必要なドメイン）を欠失したトランスジーン（per⊿PAS）を作製し，LNds特異的なper⊿PASの強制発現により長期記憶や睡眠にどのような影響が見られるかを検証する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
OK348およびdrl[PGAL8]という２つのGAL4系統のPER発現ニューロンを調べたところ，dorsal latera neurons (LNds)とventral lateral neurons (LNvs)という2つの神経集団を見出した。記憶や睡眠の制御にかかわるPER発現ニューロンがLNvsなのか，それともLNdsなのかを明らかにする必要が生じたため，行動解析よりもLNds特異的かつLNvsでは発現しないGAL4系統の探索を優先させた。よって，行動解析関連の消耗品費の利用頻度が低下したため，次年度使用額が生じた。
H26年度から行動解析を実施することにより行動解析関連の消耗品費を使用する。また，行動解析に利用する形質転換バエ作製にかかわる消耗品費としても一部利用する計画である。
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[Journal Article] Insulin-producing cells regulate the sexual receptivity through the Painless TRP channel in Drosophila virgin females.2014
Author(s)
Sakai, T., Watanabe, K., Ohashi, H., Sato, S., Inami, S., Shimada, N., Kitamoto, T.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e88175
DOI
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