2014 Fiscal Year Research-status Report
後脳・脊髄と網膜に存在する新奇GnRH産生細胞群の生理機能
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25650118
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
日下部 岳広 甲南大学, 理工学部, 教授 (40280862)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | GnRH / メダカ / 中枢神経系 / 網膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、GnRH2遺伝子の転写制御領域を蛍光レポーターに連結したDNAを組み込んだトランスジェニック個体を用い、GnRH2を発現する細胞の同定を試みた。二光子励起レーザー顕微鏡を用いた解析により、中枢神経系深部および網膜におけるGnRH2産生細胞および神経軸索の分布を明瞭に明らかにすることができた。また、系統発生学的比較解析によって知見を得ることを目的として、後脳および脊髄における新奇GnRH細胞群をみいだす端緒となったホヤ幼生のGnRH神経系の解析を並行して行った。GnRH投与や機能阻害実験により、GnRHがホヤ幼生において変態の制御に関わっていることを明らかにした。
個体レベルのGnRHの機能解析実験として、前年度にはアンチセンスMOや mRNAのメダカ卵への顕微注入によって、メダカGnRH2を一過的に機能阻害あるいは強制発現した個体を作製して解析を行い、神経系や網膜の発生過程に関与する可能性が示唆された。しかし、アンチセンスMOによる機能阻害の効果は一過的であるため、永続的に機能阻害する方法として、２６年度は、近年開発されたCRISPR-Cas9法を用いた遺伝子破壊個体の作製を行った。GnRH２遺伝子中のGnRHペプチドをコードする領域を標的としてガイドRNAを設計し、Cas9ヌクレアーゼmRNAとともに、メダカ受精卵に顕微注入法により導入し、GnRH２欠損個体の作製を試みた。その結果、F0個体において、高頻度でGnRH２コード配列に欠失変異をもつ個体を得ることができた。さらに、ゲノム編集を施したF0個体を野生型個体とかけあわせて、GnRH2欠損変異をヘテロにもつF1個体の作製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CRISPR-Cas9法を駆使したゲノム編集技術を用いて、遺伝子欠損メダカ個体を作製することに成功したことは、GnRHの生理機能を個体レベルで解析する上で大きな進歩と言える。当初、26年度中に表現型の解析まで行う計画であったが、ヘテロ接合のF1個体の作製に留まったことから、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
GnRH2欠損変異をヘテロ接合でもつ個体どうしのかけあわせによって、変異をホモ接合にもつ個体を得て、表現型解析を行うことにより、GnRHの新奇生理機能に関して重要な知見が得られると期待できる。
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| Causes of Carryover |
「現在までの達成度」で述べた通り、当初、26年度中にGnRH2欠損個体の表現型の解析まで行う計画であったが、安定した表現型解析のためにはF2世代以降の系統化した個体を使用することが望ましいことが判明し、表現型解析は次年度に行うこととしたため、未使用の経費が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ホモ接合でGnRH2欠損変異をもつメダカ個体の表現型解析と成果発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てる計画である。
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