2016 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of novel plant genome modification technology using bacterial Type4 Secretion System
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25660007
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
守口 和基 広島大学, 理学研究科, 講師 (30294523)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 四型分泌系（T4SS） / プラスミド / ジーンターゲティング技術の開発 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、先行研究で知られていたRP4プラスミドが自身のT4SSにより出芽酵母へ自身を移行させる現象が、移行したRP4プラスミドが受容酵母内で自己環状化する現象を発見したことを端緒にし、植物のジーンターゲティング技術の開発に応用することを目指した。H25年度はRP4プラスミドの輸送系を用いて植物培養細胞への移行の検出、および移行効率の上昇を目指して研究を進めたが、安定形質転換体は得られなかった。しかし、アグロバクテリアのVirB/D4 T4SSがpBBRプラスミドを植物細胞内へ高効率に輸送でき、プラスミドが自己環状化することを新たに発見したため、H26, 27年度はこのシステムの応用を目指し、基本メカニズムの解析とこのシステムを利用したターゲティングベクター、ヘルパープラスミドおよびターゲティング検出用タバコ培養細胞の開発を行った。また、これまで比較検討のために用いていたRP4 T4SSによる出芽酵母への遺伝子導入系のデータをまとめ、論文として報告した。最終年度のH28年度は、前年度までに作成した材料を用い、ジーンターゲティングの検出に専念した。具体的にはプロモーター+C末端欠損型uidA遺伝子を保持するタバコ培養細胞へ、植物で発現させると相同組み換え効率を上昇させるとの報告のあったyRAD54遺伝子、もしくはターゲットDNAに傷を入れDNA修復を誘導するCRISPR/CAS9システムを導入したヘルパープラスミドと、N末端欠損型uidA遺伝子+aph4融合遺伝子を保持するターゲティングベクターを、VirB/D4 T4SSを用いて同時導入した。さらにベゴモウイルス複製起点及び複製関連遺伝子を導入し植物細胞内でのコピー数を上昇させた改変型ターゲティングベクターも試したが、何れの組み合わせにおいてもジーンターゲティング現象を検出することはできなかった。
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