2013 Fiscal Year Research-status Report
3-デオキシアントシアニン生合成経路の解明と代謝制御による新規花色創出
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25660030
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Iwate Biotechnology Research Center |
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Principal Investigator |
西原 昌宏 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 細胞工学研究部, 研究部長 (20390883)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | フラボノイド / 3-デオキシアントシアニン / シニンギア / 遺伝子工学 / RNA-seq / 花色 |
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| Research Abstract |
本年度はイワタバコ科植物シンニンギア（Sinningia cardinalis）の花弁(赤花と白花)についてIllumina社 HiSeq2000によりRNA-seq法による全転写産物解析を行った。
両花弁サンプルとも、約50億塩基対の配列データが得られ、de novoアッセンブル後、赤花19,506（平均長454bp）、白花19,679(平均454bp)のUnigeneが獲得された。バイオインフォマティックス解析によりCDSの予測、GOアノテーションを行い、フラボノイド生合成関連遺伝子のカタログ化を行った。その結果、これまでシニンギアで報告されているジヒドロフラボノール還元酵素（DFR）/フラバノン還元酵素(FNR)、アントシアニジン合成酵素（ANS）,フラバノン水酸化酵素（F3H）等のフラボノイド生合成関連遺伝子に加えて、カルコン合成酵素（CHS）、カルコン異性化酵素（CHI）、フラボン合成酵素（FNSII）、フラボノイド3′水酸化酵素（F3′H）、アントシアニジン還元酵素（ANR）等のシニンギアで未同定の遺伝子配列が含まれていた。また、白花と赤花の発現量に差異のある遺伝子を抽出した結果、CHS遺伝子の発現が白花で有意に低下しており、変異遺伝子と推定された。一方、3-デオキシアントシアニンを花弁に蓄積させるためにはF3H遺伝子の抑制系統が必須であるが、トレニア白系統を用いて、F3H変異体を同定した。特に、候補遺伝子のANR様遺伝子については5種類の配列が得られており、全長がクローニングされたもの４種類について、植物形質転換用のバイナリーベクターを作出し、トレニア白系統への導入を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次世代シークエンスを用いたRNA-seq解析により、シニンギア花弁における転写産物の配列情報が獲得された。当初予定通り、得られた配列から目的の3-デオキシアントシアニンの生合成に関わる生合成酵素遺伝子の探索を進めている。候補遺伝子として、複数のANR-like 遺伝子が得られており、その全長配列の単離も遂行中である。また、3-デオキシアントシアニンの蓄積にはフラバノン3水酸化酵素遺伝子(F3H)の発現が抑制されることが必須条件であるが、トレニア白花色変異体を詳細に解析した結果、F3H遺伝子のプロモーターに新規レトロトランスポゾン(TORE1)が挿入されており、3-デオキシアントシアニンのエンジニアリングに向けて、最適な材料であることが判明した。現在、バイナリーベクターを構築し、トレニアの形質転換実験を開始しており、概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究ではシニンギア花弁からの3-デオキシアントシアニン生合成の鍵酵素の探索を進めており、これまで得られた候補遺伝子について、3-デオキシアントシアニン生合成に関与するか否かを追求する予定である。最終的に遺伝子組換え手法を用いて3-デオキシアントシアニンを花弁に蓄積させる手法を確立する。一方、ソルガムでは本生合成経路に関わる遺伝子として、ANR遺伝子の関与が報告されている。そこで、本遺伝子についても導入遺伝子の１つとして検討し、シニンギアからの遺伝子単離が達成できなかった場合の代替え遺伝子として利用することを対応策とする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
候補遺伝子の単離が終了し、遺伝子組換え用バイナリーベクターの構築まで実施したが、形質転換実験が開始したところで、次年度以降、本格的に実験を実施する予定であるため。
候補遺伝子の解析、遺伝子組換えトレニアの作出を実施する。
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