2014 Fiscal Year Research-status Report
花弁柔細胞で早期老化を引き起こすヌクレアーゼ機構の解明
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25660032
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
望月 寛子 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 花き研究所花き研究領域, 主任研究員 (60450318)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ヌクレアーゼ / 柔細胞 / チューリップ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、チューリップ ‘イルデフランス’の老化した内花被から柔細胞のみをサンプリングし、SDS-PAGE法を用いたIn-gel DNase assayによってヌクレアーゼ活性を検証した。その結果、分子量30kDa付近にバンドを確認し活性の特徴を検証した。平成27年度は検出したヌクレアーゼ活性の生化学的な特徴を既報ヌクレアーゼと比較検証する【実験１】。平成25年度に作成したチューリップ'イルデフランス'のESTデータベースを解析した結果、64,922のコンティグと3,712のシングレットが得られた。アノテーションが得られたコンティグは59,998であり、ESTデータベースを解析したところ、ヌクレアーゼ遺伝子のホモログが少なくとも65含まれていた。ESTデータベースにNCBI登録済のチューリップ遺伝子配列と、degenerateプライマーで取得したS1P1ヌクレアーゼ遺伝子配列を追加し、アジレント社のeArrayプログラムを用いてプローブ設計とマイクロアレイを行った。また、マイクロアレイ解析とは別に、ユリ‘イエローウィン’の表皮細胞と柔細胞を分離サンプリングし、degenerateプライマーによってヌクレアーゼ遺伝子の単離と発現解析を行った。単離したヌクレアーゼ遺伝子のホモログは開葯０日目から発現しており、表皮細胞に比べ柔細胞で早期に発現が上昇することを確認した。平成２７年はチューリップマイクロアレイ解析の結果と、実験１の生化学的実験結果を合わせて、候補遺伝子（花弁柔細胞で発現し、double strand DNAに対して基質優先性を有するヌクレアーゼ）の特定を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヌクレアーゼ活性の生化学的な検証はほぼ予定通り進行している。遺伝子の解析については、初年度にサブトラクション法からマイクロアレイへ手法を変更したことに伴い、データ解析に想定以上の時間を要したが、EST情報から候補遺伝子を事前に絞ることができ、全体として順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在確認済みのヌクレアーゼ活性の特徴をまとめ、これまで植物において報告されているヌクレアーゼの特徴と比較検討する（実験１）。遺伝子解析については、マイクロアレイ解析によって得られた候補遺伝子の発現解析およびin vitro系でのヌクレアーゼ活性の検証を目指す（実験２）。
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| Causes of Carryover |
初年度（平成２５年度）、遺伝子解析の手法をサブトラクションからESTの作成およびマイクロアレイに変更した。その結果、平成２６年度は実験手法が一部変更となり、実験補助員の雇用が不要となったために次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
PCR関連試薬等の購入、実験補助員の雇用、さらに研究成果公表のための論文投稿費として使用予定である。
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