2013 Fiscal Year Research-status Report
疑似有性生殖による植物共生糸状菌の進化機構の解明とその利用
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25660036
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
竹本 大吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30456587)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 共生菌 / Epichloaeエンドファイト / ライグラス |
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| Research Abstract |
Epichloae（Epichloe/不完全菌Neotyphodium属）エンドファイトは、イネ科牧草/芝草の細胞間隙で伸長し、共生関係を保っている糸状菌エンドファイトである。不完全菌であるNeotyphodium属エンドファイトは植物の種子を介して繁殖するため、外界の微生物や近縁種と遭遇する機会は限られているにも関わらず、生理活性物質の生産性などに著しい多様性が認められる。以前よりNeotyphodium属エンドファイトは疑似有性生殖を介して進化したと推察されているが、詳細は明らかではない。そこで、本研究では、in vitroでの Epichloe属菌間とNeotyphodium属菌の疑似有性生殖の細胞学的観察、宿主植物内での疑似有性生殖による新奇菌種の作出、疑似有性生殖によって得られた菌種のゲノム構造の解析、疑似有性生殖を用いた有用遺伝子のピラミッティング法の確立を行い、糸状菌進化における疑似有性生殖の役割の解明と有効な利用法の確立を目指している。本年は、異なるE. festucae菌株にハイグロマイシンまたはジェネティシン耐性遺伝子を導入し、同時にGFPあるいはDsRedにより蛍光ラベルすることで、菌糸融合と疑似有性生殖の結果現れた菌株を簡易に単離する実験系の確立に成功した。また、核局在性タンパク質であるNsiAと蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現した菌株を作出し、菌糸融合の後に核がパートナー細胞に移行する様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに、疑似有性生殖に用いる菌株における耐虫性に関わるペラミン生合成遺伝子（PerA）およびロリン生合成遺伝子（LolAなど）、家畜に毒性を占めすロリトレムBの産生に関わるロリトレムB生合成遺伝子（LtmEなど）の分布を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、E. festucae菌株Fl1、抗菌性の高いE437株、ゲノム配列が明らかな2638株に、DsRed（ハイグロマイシン耐性）およびGFP（ジェネティシン耐性）を導入し、これらの菌糸融合と疑似有性生殖の結果現れた菌株の単離に成功した。また、Fl1株に核局在性タンパク質であるNsiA-GFPを発現した菌株を作出し、菌糸内での核の形態や、胞子形成、菌糸融合時における核の挙動を詳細に観察した。さらに菌糸融合の後に核がパートナー細胞に移行する様子を経時的に観察した。また、Fl1株、E437株、2638株における耐虫性に関わる遺伝子群、家畜に毒性を示す物質の産生に関わる遺伝子群のなどの分布を明らかにし、疑似有性生殖後に得られた菌株においてこれら遺伝子の分布が簡易に確認できる様になった。このように、今年度は今後の解析に必要な実験系の確立が順調に進められたことより、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) Hybrid株のゲノム配列の解読と親株のゲノム構造と比較解析 これまでに、疑似有性生殖によって得られた菌株のゲノム配列が解析された例はない。そこで、異種間での疑似有性生殖によって作出された新たな菌種の全ゲノム配列を解読し、ゲノムの再構築を明らかとする。まず、疑似有性生殖の用いるE. festucae Fl1株およびNeotyphodium属菌株におけるNsiA-GFPあるいは、NsiA-DsRed発現ベクターの挿入様式を調査する。サザンブロット解析により、1コピーのベクターが挿入された菌株を選抜する。次に、次世代シークエンサーを用いて2つの親株および独立した実験より単離された4つのhybrid株の全ゲノム配列を解読し、5つのゲノム配列のアセンブリとゲノム構造の比較を行う。得られたゲノム配列から、ゲノムサイズ、hybridゲノムでのトランスポゾンの分布、相同遺伝子の重複、4つの独立したhybrid株間のゲノム共通性と多様性など、疑似有性生殖によっておこるゲノムの再構築を詳細に調査する。
2) 疑似有性生殖による有用遺伝子のピラミッティング法の確立 ハイグロマイシン耐性E. festucae Fl1株および、ジェネティシン耐性2368株を作出する。ハイグロマイシンおよびジェネティシンに耐性のhybrid株を独立した対峙培養および単分生子分離から多数得る。得られたhybrid菌株群におけるペラミン生合成遺伝子（PerA）およびロリン生合成遺伝子（LolAなど）の分布を調べる。また、家畜に毒性を占めすロリトレムB生合成遺伝子（LtmEなど）を失ったhybrid菌も同時に探索する。さらに野生株のE. festucae Fl1株および2368株を対峙培養し、コロニーが交差した部位から分生子を得る。様々な栄養条件での疑似有性生殖が起きた菌株の比率を調べ、薬剤耐性遺伝子を用いない実験系での効率を調査する。
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