核形態チェックポイント：核形態異常によりもたらされる核分配停止機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660055
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 善晴 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70203263)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: メチルグリオキサール / Saccharomyces cerevisiae / 核分裂 / 液胞

Research Abstract

われわれは、メチルグリオキサール（MG）という細胞内代謝物が、酵母の核形態を成長軸に対して垂直に扁平な形（ジェリービーンズ型核形態）に変形させるとともに、娘細胞への核分配を停止させることを発見した。しかしながら、核形態の異常がトリガーとなって核分配の停止が引き起こされるかどうかは明らかではない。本年度は、MG処理による核形態変化が、細胞内MGレベルの上昇によりもたらされるのか、あるいは細胞外にMGが存在することが何らかの刺激になって引き起こされるのかについて検討するため、細胞に取り込まれてMGに非酵素的に変換されるジヒドロキシアセトン（DHA）を用いて検討を行った。その結果、DHA処理によっても、MGの場合と同様にジェリービーンズ型核形態変化が観察された。
一方、核形態に影響を与える応力を発生させる可能性のある要因として液胞形態に着目した。液胞はNVJを介して核と接触していることから、NVJを形成するNvj1とVac8をそれぞれ欠損させた株について核形態を観察したところ、Nvj1欠損株では野生株と同じようにMGにより核形態変化と核分配阻害が起こったが、Vac8欠損株ではこれらの表現型がやや抑制された。このとき、液胞の形態を観察すると、Vac8欠損株では液胞がややシュリンクした形態をしていた。MG処理により液胞が融合し、一つの大きな液胞に変化していた。このことが、核形態を変化させる応力を発生させている可能性が考えられたので、液胞融合に関与するHOPS複合体のうちVps41、ならびに液胞膜のt-SNAREのVam3が欠損した株について液胞形態と核形態、ならびに核分裂について検討を行った。その結果、液胞の融合ができないこれらの株では、MG処理でも液胞の融合（肥大化）は観察されず、ジェリービーンズ型核形態変化、ならびに核分配阻害は観察されなかった

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

MG処理により、酵母の核に関して2つの事象が観察される。一つは核形態が成長軸に対して扁平に変形し、ジェリービーンズのような核形態になるということであり、もう一つは核分配が停止してしまうことである。この2つの現象を関連づけて解析する手段として、MG存在下でも核形態に異常が見られない変異株、あるいはMG存在下でも核分配が行われる変異株の取得と解析から、MGによってもたらされる核形態と核分配の異常に関するメカニズムの解明が期待される。一方、球形の核がジェリービーンズ型の形態に変化するには、外部からの物理的な圧力（応力）も必要である。これらの解析のうち、本年度ではジェリービーンズ型核形態変化をもたらす応力が、液胞の肥大化によってもたらされていることを明らかにすることができた。DHA処理によっても液胞の肥大化が観察されたことから、MGは何らかの機構で液胞の融合を促進していると考えられる。一方、核形態に関する変異株の取得に関しては、現在も継続してスクリーニングを進めている。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度の解析から、ジェリービーンズ型核形態変化は必ずしも核分裂を阻害する要因ではないことが明らかとなったことから、平成26年度では、何が原因で核分裂が阻害されるのかを明らかにする。このことを検討するに当たり、核の分配に関与するマシナリーの機能や局在性について検討を行う。具体的には、核分配に関与するBim1、Bik1、Kar9の局在性を観察するため、それぞれのタンパク質にGFPやRFPタグを付加した遺伝子を作成する。また、SPBマーカーとしてSpc29ならびにSpc110に蛍光タンパク質のタグを付加した遺伝子を作成する。一方、微小管の形成はチューブリンであるTub1に蛍光タンパク質を付加し、これらのタンパク質の局在性を野生株、ならびに平成25年度に取得した変異株へ導入し蛍光顕微鏡を用いて観察を行う。尚、本年度の研究結果から、ジェリービーンズ型核形態は核分裂阻害とは必ずしも相関しないことが明らかとなったので、核分配に関わるマシナリーのMG存在下での局在解析を中心に行う予定である。その代わり、液胞形態が核形態に影響を与えることが明らかになったので、液胞形態に関与するホスファチジルイノシトール分子種レベルに及ぼすメチルグリオキサールの影響を新たな検討項目として加える。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

メチルグリオキサールによる核形態変化と核分裂阻害との相関性を解析した結果、核の形態変化が必ずしも核分裂阻害と相関していないということが明らかとなった。当初の計画では、S. cerevisiaeの非必須遺伝子破壊株ライブラリー約4800株へ、核形態を観察するためのNup116-GFPを網羅的に導入するために係る経費を計上していたが、その計画に変更があったため、使用額に変更が生じた。
平成25年度に新たに得られた成果として、液胞形態が核形態に重要な影響を及ぼすことが分かった。そこで、液胞の形態と関連するホスファチジルイノシトール分子種の定量を、平成26年度では行うことにした。この実験は当初の計画では盛り込んでいなかったので、前年度に消化しなかった研究経費は、本実験で用いる予定である。