2014 Fiscal Year Research-status Report
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25660066
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| Research Institution | Tohoku Gakuin University |
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Principal Investigator |
大坪 和香子 東北学院大学, 公私立大学の部局等, 研究員 (00598203)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | コガタルリハムシ / 腸内細菌叢 / 16S rRNA遺伝子 / T-RFLP / 次世代シーケンサー / ゲノム支援 / 特定国派遣ドイツ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、本研究課題が文部科学省科学研究費新学術領域研究の「ゲノム支援」課題に採択され、さらには研究代表者が本研究課題に関連する内容で特定国派遣研究者に採用されたことから、コガタルリハムシおよびその近縁種でありヨーロッパ在来ハムシGastrophysa viridulaの共生細菌のメタ16S ／メタゲノム比較解析を行う基盤を構築することができた。
コガタルリハムシおよびG. viridulaをそれぞれ日本およびドイツ国内の複数箇所で採集し、３齢幼虫から腸DNAを抽出した。これらのDNAを鋳型とした16S rRNA遺伝子の増幅、T-RFLPおよびクローン解析を行ったところ、当該２種のGastrophysa属ハムシは地域的および進化的隔離があるにも関わらず共生細菌の群集構造は共通性が高いことを明らかにした。
その一方で、採集地点が同じ試料においてもT-RFの検出頻度や各細菌種の割合には差異があり、同種ハムシにおける共生細菌叢の群集構造は生長過程に伴って変化することが示唆されたため、１齢幼虫についても16S rRNA遺伝子解析を行ったところ、通常のPCR条件では産物が得られなかったことから、無菌状態の卵から孵化した１齢幼虫に共生する細菌は極めて少ないことが知られた。
Gastrophysa属ハムシの腸内共生細菌叢では、Rahnella aquatilisと16S rRNA遺伝子において99%の相同性のある細菌が優勢化しており、前年度までの研究においてコガタルリハムシの蛹化直前の３齢幼虫体内で優勢化していたLactococcus属乳酸菌についてはハムシが防御物質として分泌する体液中に多く存在していることが明らかになった。
また、ゲノム支援事業の協力のもと、日本およびドイツ国内の複数箇所において採集したコガタルリハムシおよびG. viridulaの腸および分泌体液から抽出したDNAを、メタ16S解析（20試料）およびメタゲノム解析（4試料）を行うための試料調製を行い、次世代シーケンサーMiSeqによるシーケンス解析を現在行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度は、日本国内のコガタルリハムシ採集可能時期（４～６月）が特定国派遣（ドイツ）の時期と重なったために、本来予定していたコガタルリハムシからの乳酸菌およびシュウ酸分解菌の単離を行うことができなかった。
しかし当該年度中に、乳酸菌が腸内よりも分泌体液中で優勢化していたことが明らかになり、分泌体液から抽出したDNAを鋳型としたメタゲノム解析がゲノム支援事業により可能になったことから、培養非依存的な遺伝子・ゲノム情報に基づいた乳酸菌の共生機能の解明ができると考えている。
共生細菌のシュウ酸分解能についても、当該年度に行った2種のGastrophysa属から抽出した腸DNAを鋳型としたT-RFLP解析において、Rahnella aquatilisをはじめとしたEnterobacteriaceaeが優勢化していることが知られたことから、腸DNAを鋳型としたメタゲノム解析（ゲノム支援事業）により、これらの細菌が有している可能性が高いシュウ酸分解に関与する遺伝子の探索および同定を単離に先行して行うことが可能である。
「抗菌活性」に関しては、当初予定していた乳酸菌単離菌株の抗菌スペクトルを調べることは叶わなかったが、当該年度中にコガタルリハムシ分泌体液中に乳酸菌が優勢化していることが明らかになったため、分泌体液そのものを用いた抗菌活性を、研究協力者の小島紀幸氏（東北学院中学高校）の協力のもと、今後調べる予定である。
上述したように、進展状況は順調だと言える一方で、シュウ酸分解能に関しては、当該年度中に試みたシュウ酸分解能のある腸内共生細菌の単離やシュウ酸分解酵素遺伝子のPCR検出は成功しておらず、メタゲノム中の機能遺伝子の探索に頼っている状況である。このことから、平成２７年度は単離菌株の獲得およびメタゲノム解析の両アプローチにおいて、当初の目的を達成するように努力する。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である本年度は、昨年度実施できなかったコガタルリハムシ試料から乳酸菌およびシュウ酸分解細菌の単離を試み、それらの共生機能を知るための知見を獲得する。
特に、平成26年度中に明らかになった分泌体液で優勢化する乳酸菌および腸内細菌叢で優勢化するRahnella aquatilisの単離獲得を目指す。
また、現在ゲノム支援事業において次世代シーケンサーMiSeqを用いてシーケンス解析を行っている16S rRNA遺伝子データの系統、統計学的解析を行い、2種のGastrophysa属ハムシにおける腸内細菌叢および分泌体液細菌叢の地域的差異を明らかにし、明治以降からコガタルリハムシがエゾノギシギシを選択的に摂食するようになった短期的進化と腸内細菌叢の多様性の関連性を明らかにする。
さらには、2種のGastrophysa属ハムシの腸内細菌叢および分泌体液細菌叢のメタゲノムデータから、シュウ酸脱炭酸酵素をはじめとしたシュウ酸分解に関与する酵素遺伝子および抗菌ペプチド等抗菌物質をコードする遺伝子の探索を行い、その遺伝子およびアミノ酸構造の特徴を明らかにする。
昆虫腸内共生細菌は一般的に単離が困難であることが知られているため、単離菌株の獲得は挑戦的要素が多い部分ではあるが、それを補うために培養非依存的手法（メタゲノム解析）による解析を遂行し、当該研究課題の目的を達成していきたい。
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