2015 Fiscal Year Annual Research Report

シアノバクテリアを利用した膜タンパク質大量生産系の構築

Research Project

Project/Area Number	25660075
Research Institution	Ibaraki University
Principal Investigator	木村成伸茨城大学, 工学部, 教授 (90291608)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	膜タンパク / 発現系 / シアノバクテリア / チラコイド / 膜移行シグナル / 構造解析
Outline of Annual Research Achievements	膜タンパク質は，細胞の物質輸送，シグナル伝達，エネルギー代謝などに重要な役割を果たしている。しかし，培養が容易な微生物を用いた遺伝子組換え型膜タンパクの大量発現系が無いことが，X線結晶構造解析等による膜タンパク質の立体構造解析や機能研究を困難にしている。本研究では，細胞内に発達した膜構造（チラコイド膜）を持ち，大量培養が容易なシアノバクテリア（ラン藻）を宿主に用いて，異種膜タンパクをチラコイド膜上に局在化・大量発現させ，単離・調製する方法を開発することを最終目的としている。最終年度のH27年度は，本研究の核心部分であるシアノバクテリアのチラコイド膜への膜移行シグナルの探索を重点的に進めた。まず，前年度までに作製した発現系を用いて細胞内に蓄積された検出用タグ（His-tag）付加チラコイド膜局在化タンパクがチラコイド膜画分にあることを明らかにし，作製した発現，検出系が目的通り機能することを確認した。次に，チラコイド膜画分への発現が確認されたチラコイド膜局在化タンパクの膜移行シグナルであると推定されるアミノ酸配列を付加したHis-tag付き異種生物由来のフェレドキシン還元酵素BphA4遺伝子の発現プラスミドを構築してシアノバクテリアに導入し，His-tagに対する特異的抗体を用いて発現と局在をしらべた。その結果，His-tag付加BphA4がチラコイド膜画分に存在することを示唆する結果を得た。この結果は，本実験で用いたチラコイド膜局在化タンパクの膜移行シグナルを用いることによって異種生物由来タンパク質をチラコイド膜上に移行できる可能性を示す結果である。今後も引き続き最終目的の達成に向けて，チラコイド膜への発現タンパクの移行と局在を詳細にしらべると共に，異種生物由来膜タンパク質のチラコイド膜への大量発現，精製を試みる予定である。