リグニン重合酵素のマルチノックアウトによる低リグニン・易分解性変異体植物の創出

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660140
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 堤 祐司 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30236921)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ペルオキシダーゼ / マルチノックアウト / 低リグニン / 易分解性リグニン / エネルギー植物 / 遺伝子工学 / プロモータ / タンパク局在

Research Abstract

(1)シロイヌナズナCWPO-Cホモログのマルチノックアウト変異体の作製：　シングルノックアウト変異体（atprx2、atprx25、atprx71）をそれぞれ交配（atprx2×atprx25、atprx2×atprx71、atprx25×atprx71）させた。交雑種子を発芽・生長後、植物体のロゼット葉からDNAを抽出し、3つのCWPO-Cホモログ遺伝子について野生型と変異型に特異的に設計した6種類のプライマーを用いたPCRによって雑種第一代（F1）の確認を行った。F1の自家受粉によって得られたF2のからダブルノックアウト変異体（atprx2/atprx25、atprx2/atprx71 、atprx25/atprx71）をPCRによって選抜し、種子（F3）を取得した。現在atprx2/atprx25とatprx25/atprx71を交配させることにより、トリプルノックアウト変異体（atprx71/atprx25/atprx71）を作製中である。
(2)CWPO-C抑制トランスジェニックポプラの作製：　植物発現用ベクター（p-BF2）にCWPO-C cDNAのアンチセンス抑制コンストラクトと、CWPO-Cの一部の配列に相同な配列をセンス方向と、アンチセンス方向に組み込みこんだRNA干渉誘導コンストラクトを作製した。これらの発現ベクターをアグロバクテリウム（LBA4404株）を用いて形質転換を行い、現在形質転換体の選抜を行っている。
(3)CWPO-Cプロモーター解析およびタンパク局在解析用コンストラクトの作成：　CWPO-Cプロモーター解析のためにプロモーター領域としてCWPO-Cの上流約1,800bpを単離し、レポーターとしてGUSと連結したコンストラクトを作成した。また、タンパク局在解析の目的で、CWPO-C全長配列にEGFPを連結したコンストラクトも作成した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マルチノックアウト植物体の作成は当初計画より早めに進んでいる。一方、CWPO-C抑制トランスジェニックポプラの作成は予定より時間を要している。
また、当初計画には無かった、プロモーター解析用ならびにタンパク局在解析用にのコンストラクトを作成するなど、研究展開が広がっている。

Strategy for Future Research Activity

今後もおおむね当初計画に従い研究を推進する。また、新たに計画に加えたプロモーター解析用ならびにタンパク局在解析用にのコンストラクトについても、アンチセンス抑制体ならびRNAi抑制体の作成と同時並行で進める。