組織を透明化する試薬「Scale」の魚病研究への応用

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660154
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 延東 真 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 教授 (80128355)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 二見 邦彦 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 助教 (00513459) ; 片桐 孝之 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 助教 (50361811) ; 舞田 正志 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 教授 (60238839)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 病理組織学 / 免疫学 / Scale / 感染症 / 蛍光

Research Abstract

魚類の感染症の診断は，まず病魚の外部所見から解剖により病巣部を中心に採材し，病理組織学的解析を行うといったプロセスで行われる。しかし，網羅的な観察が困難なため，病原体の局在や動態がわかりにくいなどの問題点があり，健康に見えながら，体内のどこかに病原体が潜み，ある時，排菌するいわゆるキャリアの問題を解決できなかった。またウイルスや細菌などの病原体の侵入門戸や，菌の増殖部位，体内伝播などを説明することも困難であった。
本研究では，組織を完全に透明化することができる試薬「Scale」を魚病研究に適用し，キャリア問題や病原菌の感染機構を解明するための研究基盤を確立する。具体的には，Scaleの魚類組織への適用と蛍光標識した魚類病原細菌の魚体内での分布の可視化，透明化した組織の病理組織学的解析への応用，および透明化した組織による病原体感染機構の生化学・分子生物学的解析へのアプローチである。
平成25年度は，代表的な小型魚類であるゼブラフィッシュを用い，試薬の組成や処理方法を検討し，組織の透明化における最適条件を探索した。また，Scale試薬だけでなく，近年新たに開発されたSeeDBやClearTなどについても検討した。その結果，透明度は，ClearT＞ScaleA2＞SeeDBの順であったが，いずれも魚体内の病原細菌の分布を可視化できるほど高くはなかった。鱗を除去したところ、筋肉組織は透明化されていたことから，鱗や色素胞が透明化に影響を与えることが予想された。一方，頭部，腹膜および鰓は，いずれの試薬に用いても透明にはならなかった。また，ScaleA2を用いた時のみ，鰓組織の損傷が見られた。処理時間はClearTが2日，SeeDBが1週間であったのに対し，ScaleA2では2週間であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新たな透明化試薬の導入など，当初の研究計画を一部変更した部分があったが，全体としてはおおむね順調に進展しているといえる。
平成25年度は，代表的な小型魚類であるゼブラフィッシュを用い，組成や処理方法を検討し，組織の透明化における最適条件を探索した。また，当初の計画にあったScale試薬だけでなく，近年新たに開発されたSeeDBやClearTなどの試薬についても比較検討をした。その結果，透明度は，ClearT＞ScaleA2＞SeeDBの順であることが明らかとなった。現時点では，透明度はまだそれほど高くはないが，筋肉組織は透明化されていたことから鱗や色素胞が影響していることが予想できたため，平成26年度にはこの問題を解決できると考えられる。なお，頭部，腹膜および鰓は，いずれの試薬に用いても透明にはならず，試薬の組成を再検討することが平成26年度以降の課題として残された。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度は，平成25年度に引き続き，ClearT，ScaleA2，SeeDBの3種の試薬の最適条件を検討するとともに，新たに報告されたCUBIC法についても試みる。現在課題となっている透明度の低さについては，1) あらかじめ鱗を取り除く，2) メスで開腹して試薬の浸透を早める，3) 過酸化水素で脱色する，などの処理を行うことで対応する。なお，作業の簡略化と実験魚の使用数削減のために，予備実験の段階では，ホモジナイズにより可溶化した組織を用いることも検討する。
透明化した試料から組織切片を作製する上では，透明化の前後における固定方法が重要になると考えられる。サンプルのサイズ・形態変化，処理時間，手間などの点では，現時点では当初計画していたScaleよりもClearTの方が優れていたが，in situハイブリダイゼーション（ISH）法や免疫染色への応用を考慮した場合，どの手法が最も適切か改めて検討する必要がある。そこで，実際にISHおよび免疫染色を行い，検出感度や組織や細胞の形態変化等を明らかにするとともに，必要に応じて固定液の種類と固定時間なども検討する。また，Scaleのメリットが蛍光シグナルの観察にあることから，蛍光ISHや蛍光免疫染色の可能性についても明らかにする。
さらに，特殊染色なども試み，Scale処理した組織が病理組織学的解析へどの程度適用可能かを明らかにする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初の研究計画を一部変更し，近年新たに開発されたSeeDBやClearTなど安価な透明化試薬を導入して比較検討を行ったことにより，当該年度の使用額を抑えることができたため。
当該年度に引き続き，ClearT，ScaleA2，SeeDBの3種の試薬の最適条件を検討するとともに，新たに報告されたCUBIC法についても試みる。
また，in situハイブリダイゼーション（ISH）および免疫染色を行い，検出感度や組織や細胞の形態変化等を明らかにするとともに，必要に応じて固定液の種類と固定時間なども検討する。さらに，蛍光ISHや蛍光免疫染色の可能性についても明らかにする。