組織を透明化する試薬「Scale」の魚病研究への応用

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25660154
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 延東 真 東京海洋大学, その他部局等, 教授 (80128355)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 二見 邦彦 東京海洋大学, その他部局等, 助教 (00513459) ; 片桐 孝之 東京海洋大学, その他部局等, 助教 (50361811) ; 舞田 正志 東京海洋大学, その他部局等, 教授 (60238839)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 透明化 / CUBIC / 蛍光標識 / 魚類病原細菌 / 病理組織学

Outline of Annual Research Achievements

魚類の感染症において，健康に見えながら体内に病原体が潜伏し，ある時排菌する，いわゆるキャリヤーは非常に大きな問題となっている。魚類の感染症は，病魚の病巣部を中心に採材し組織学的，分子生物学的解析を行うといったプロセスで診断される。しかし，このような二次元的，局所的な解析法では，保菌魚における病原体の潜伏機構や体内動態を三次元的，全体的に解明することが困難である。そこで，三次元的に魚体の内部構造を可視化し，その後注目すべき組織に焦点を当て詳細な解析を行うといった全体から細部に至るまで網羅できる方法が必要とされる。
これまで，Scale試薬だけでなく，SeeDBやClearTなどの使用も試みたが，組織の透明度は十分とはいえず，また組織の自家蛍光も強いため，蛍光標識したキャリヤーを観察するには多くの課題が残されていた。そこで平成27年度は，Scaleの改良法であるCUBIC法についても検討し，蛍光標識した魚類病原細菌の魚体内での分布の可視化，透明化した組織の病理組織学的解析への応用，および透明化した組織による病原体感染機構の生化学・分子生物学的解析へのアプローチを目指した。
供試魚として，黒色素胞を持たないキンギョを用いた。CUBIC処理後の魚体の透明性および組織形態の維持について調べたところ，Scale，SeeDB，ClearTで処理した場合に比べて筋肉の透明性が高く，組織の形態も維持されていた。また，抗アクチン抗体を用いた免疫染色，およびGFPを導入したEPC細胞の観察では，タンパク質の保存性も高いことが明らかとなった。さらに，アクリジンオレンジで蛍光標識したAeromonas hydrophilaをCUBIC処理した後，蛍光顕微鏡で観察したところ，CUBIC処理による褪色は見られなかった。一方，DNAはある程度保存されていたものの，RNAの保存性は低く，PCRによる定量は困難であった。CUBICに含まれるアミノアルコールの高いpHによりRNAが加水分解されていることが示唆された。