ゲノム－核内受容体の相互作用アレイによる化学物質影響評価系の開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660228
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 岩田 久人 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 教授 (10271652)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 核内受容体 / 化学物質 / スクリーニング / 種差

Research Abstract

残留性有機汚染物質（POPs）やビスフェノール類（BPs）の一部は、エストロゲン受容体（ER）を活性化することで本来のエストロゲンの応答をかく乱することが知られている。一方、環境汚染物質によるERへの作用には種差が存在する。水棲哺乳類は、水圏生態系の頂点に位置するため、これら環境汚染物質を高濃度に蓄積する。しかしながら、環境汚染物質曝露による水棲哺乳類ERシグナル伝達経路への影響に関する知見は欠如している。そこで本研究では、環境汚染物質の潜在的なリスクを評価するため、バイカルアザラシのERを介した影響のスクリーニング法の構築を試みた。
バイカルアザラシERαおよびERβ cDNAの単離に成功した。次いで、バイカルアザラシERαおよびERβ発現ベクター、ER標的遺伝子の5’上流域に存在するER応答配列を含むレポーターベクターをCOS-1細胞に導入し、in vitro レポーター遺伝子アッセイ系を構築した。このCOS-1細胞を環境汚染物質で処理し、レポーター遺伝子活性を測定することで、ER転写活性化能を評価した。またアザラシERsの機能的特性を理解するため、マウスERα・ERβについても同等のアッセイ系を構築し、同じ環境汚染物質による転写活性化能を測定した。
BPs 26種についてER転写活性化能をスクリーニングしたところ、分子量が小さく、フェニル環のpara位に付くOH基置換数が多い物質ほど高活性を示す傾向が認められた。次に、EC50とLOECを指標にERα・ERβのアイソフォーム間で結果を比較したところ、各化学物質のEC50・LOECはアザラシ・マウス両種ともに同等、もしくはERαの方が低値を示す傾向がみられた。また、アザラシとマウスの種間で転写活性化能を比較したところ、ERαについてはマウスが高感受性、ERβについては同等もしくはアザラシが高感受性である傾向が認められた。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

今年度は、バイカルアザラシエストロゲン受容体（ER）であるERαおよびERβ cDNAの単離に成功した。バイカルアザラシERαおよびERβ発現ベクター、ER標的遺伝子の5’上流域に存在するER応答配列を含むレポーターベクターをCOS-1細胞に導入し、in vitroレポーター遺伝子アッセイ系を構築することができた。その際、発現ベクターの量や細胞への導入条件などを検討し、感度の最適化をおこなった。またリガンド濃度依存的なバイカルアザラシER -ER応答配列（ERE）を介したシグナル伝達経路へ影響についても検討できた。さらに、マウスERα・ERβについても同等のアッセイ系を構築し、同じ環境汚染物質による転写活性化能も測定した。
今年度成果が当初の計画以上に進展したと考える理由は、ビスフェノール類（BPs）26種についてER転写活性化能をスクリーニングし、構造活性相関があることまで示唆できたからである。構造活性相関モデルはまだ改善の余地はあるが、ここまで研究が進展するとは研究開始時には予想していなかった。

Strategy for Future Research Activity

本研究の結果、ビスフェノール類（BPs）を含む多様な環境汚染物質がバイカルアザラシエストロゲン受容体（ER）-ER応答配列（ERE）を介したシグナル伝達経路へ影響することが示唆された。
次年度は、BPsを含む環境汚染物質のバイカルアザラシER-EREを介したアンタゴニスト活性についても調査する予定である。また、in silico で環境汚染物質とERのドッキングシミュレーションをおこない、 ER転写活性化能の定量的構造活性相関（QSAR）モデルを構築するとともに、ERアイソフォーム差・生物種差が生じる分子メカニズムについても究明する予定である。さらに、ER転写活性化能を指標とした複合汚染の影響を評価することも計画している。
これらの研究を推進することにより、ER-ERE を介したシグナル伝達経路へ影響する化学物質の構造的特徴を解明することや、種差を規定する感受性因子を特定することが期待できる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

バイカルアザラシおよびマウスERαおよびERβを発現させたin vitro レポーター遺伝子アッセイ系の実験条件検討が予想以上に速やかに終了したため。
当初の計画より精度の高い構造活性相関モデルを構築するために、in vitro レポーター遺伝子を用いてアッセイする化学物質の種類を増やすことで、繰り越した予算を使用する予定である。また、ERを介したアゴニスト活性に加え、アンタゴニスト活性についても調査することを計画している。

Research Products

• [Journal Article] Molecular and functional characterization of a novel aryl hydrocarbon receptor isoform, AHR1β, in the chicken (Gallus gallus) (2013)
  • Author(s): Lee, J. S., Iwabuchi, K., Nomaru, K., Nagahama, N., Kim, E. Y. and Iwata H.
  • Journal Title: Toxicological Sciences Volume: 136(2) Pages: 450-466
  • DOI: 10.1093/toxsci/kft192
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular evaluation of a new highly sensitive aryl hydrocarbon receptor in ostriches (2013)
  • Author(s): Fujisawa, N., Darwish, W. S., Ikenaka, Y., Kim, E. Y., Lee, J. S., Iwata, H., Nakayama, S. and Ishizuka, M.
  • Journal Title: Poultry Science Volume: 92(7) Pages: 1921-1929
  • DOI: 10.3382/ps.2013-03090
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Alternative in vitro approach for assessing AHR-mediated CYP1A induction by dioxins in wild cormorant (Phalacrocorax carbo) population (2013)
  • Author(s): Thuruthippallil, L. M., Kubota, A., Kim, E. Y. and Iwata, H.
  • Journal Title: Environmental Science and Technology Volume: 47(12) Pages: 6656-6663
  • DOI: 10.1021/es401155g
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sex differences in the accumulation of chlorinated dioxins in the cormorant (Phalacrocorax carbo): implication of hepatic sequestration in the maternal transfer (2013)
  • Author(s): Kubota, A., Yoneda, K., Tanabe, S. and Iwata, H.
  • Journal Title: Environmental Pollution Volume: 178 Pages: 300-305
  • DOI: 10.1016/j.envpol.2013.03.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Potencies of red seabream AHR1- and AHR2-mediate transactivation by dioxins: implication of both AHRs in dioxin toxicity (2013)
  • Author(s): Bak, S. M., Iida, M., Hirano, M., Iwata, H. and Kim, E. Y.
  • Journal Title: Environmental Science and Technology Volume: 47(6) Pages: 2877-2885
  • DOI: 10.1021/es304423w
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative analysis of the interaction of constitutive androstane receptor with chemicals and steroid receptor coactivator 1 using surface plasmon resonance biosensor systems: a case study of the Baikal seal and the mouse (2013)
  • Author(s): Dau, P. T., Sakai, H., Hirano, M., Ishibashi, H., Tanaka, Y., Kameda, K., Fujino, T., Kim, E. Y. and Iwata, H.
  • Journal Title: Toxicological Sciences Volume: 131(1) Pages: 116-127
  • DOI: 10.1093/toxsci/kfs288
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toxic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on the peripheral nervous system of developing red seabream (Pagrus major) (2013)
  • Author(s): Iida, M., Kim, E.Y., Murakami, Y., Shima, Y. and Iwata, H.
  • Journal Title: Aquatic Toxicology Volume: 128-129 Pages: 193-202
  • DOI: 10.1016/j.aquatox.2012.12.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toxicokinetics of dioxins and other organochlorine compounds in Japanese people: association with hepatic CYP1A2 expression levels (2013)
  • Author(s): Watanabe, M. X., Kunisue, T., Ueda, N., Nose, M., Tanabe, S. and Iwata, H.
  • Journal Title: Environment international Volume: 53 Pages: 53-61
  • DOI: 10.1016/j.envint.2012.12.008
  • Peer Reviewed
• [Presentation] In silico 解析による化学物質と核内受容体・シトクロムP450の相互作用の評価 (2013)
  • Author(s): 岩田久人，平野将司， Kim Eun-Young
  • Organizer: 環境ホルモン学会 第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20131212-20131213
  • Invited
• [Presentation] TCDD曝露したマダイ胚のトランスクリプトーム解析 (2013)
  • Author(s): 飯田 緑，藤井 聡，内田雅也，中村 浩，鏡 良弘，Bak Su-Min，Kim Eun-Young，島 康洋，岩田久人
  • Organizer: 環境ホルモン学会 第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20131212-20131213
• [Presentation] Identification of amino acid residues critical for ligand binding and transactivation in ecdysone receptor (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Ishibashi, H., Kim, E. Y., Arizono, K. and Iwata, H.
  • Organizer: 環境ホルモン学会 第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20131212-20131213
• [Presentation] ホッキョクグマのシトクロムP450 1Aおよび2BによるPCBs代謝能力の評価 (2013)
  • Author(s): 古池 幸，平野将司，鈴木賢一，Yoo Jean，阿草哲郎，Thomas J. Evans，Kurunthachalam Kannan，岩田久人
  • Organizer: 環境ホルモン学会 第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20131212-20131213
• [Presentation] Effect of aryl hydrocarbon receptor variants and hnRNPA2/B1 on dioxin-induced cyp1a1 transactivation in MRL/lpr and C3H/lpr (2013)
  • Author(s): Cho, S. W., Suzuki, K. I., Miura, Y., Watanabe, M., Miyazaki, T., Nose, M., Iwata, H. and Kim, E. Y.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Isoform-specific transactivation and autoinduction of aryl hydrocarbon receptors by dioxins in the red seabream (Pagrus major) (2013)
  • Author(s): Bak, S. M., Iida, M., Iwata, H. and Kim, E. Y.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Thyroid hormone-mediated effects of dioxins in wild Baikal seals (Pusa sibirica) (2013)
  • Author(s): Iwata, H., Hirakawa, S., Eguchi, A., Imaeda, D., Kunisue, T., Kim, E. Y., Kannan, K., Petrov, E. A., Batoev, V. B. and Tanabe, S.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Polychlorinated biphenyls and their hydroxylated metabolites (OH-PCBs) in the Baikal seals and implication from toxicogenomic approach (2013)
  • Author(s): Nomiyama, K., Eguchi, A., Hirakawa, S., Kanbara, C., Imaeda, D., Kim, E. Y., Iwata, H. and Tanabe, S.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Functional characterization of aryl hydrocarbon receptor from the polar bear (Ursus maritimus) (2013)
  • Author(s): Hwang, J. H., Jeong, L. R., Kannan, K., Evans T. J., Iwata, H. and Kim, E. Y.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] In vitro and In silico analyses to predict the effects of environmental chemicals through the mysid ecdysteroid receptor signaling pathway (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Ishibashi, H., Kim, E. Y., Arizono, K. and Iwata, H.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Homology modeling and ligand docking simulations of avian AhRs to decipher the interspecies differences in responses to dioxins (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Kim, E. Y., Bak, S. M. and Iwata, H.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN2013)
  • Place of Presentation: Daegu, Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] Identification of cytochrome P450 enzymes in phenobarbital-treated mouse liver microsomes using 2-DE and MALDI-TOF/TOF (2013)
  • Author(s): Lauan, M. C., Suzuki, K., Agusa, T. and Iwata, H.
  • Organizer: 3rd International Conference on Proteomics and Bioinformatics
  • Place of Presentation: Philadelphia, USA
  • Year and Date: 20130715-20130717
• [Presentation] In vitro approach to predict AHR-mediated CYP1A induction by dioxins in cormorant population (2013)
  • Author(s): Iwata, H., Thuruthippalli, L. M., Kubota, A. and Kim, E. Y.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Presentation] In silico analysis of avian AHRs to decipher the molecular basis for interspecies diffrences in responses to dioxins (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Bak, S. M., Iwata, H. and Kim, E. Y.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Presentation] Identification of quantitative trait loci (QTL) associated with inorganic arsenic metabolism using recombinant inbred strains of mice (2013)
  • Author(s): Agusa, T., Komori, H., Soga, Y., Nose, M., Mori, S., Kubota, R., Tanabe, S. and Iwata, H.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Presentation] Identification and functional characterization of a novel chicken aryl hydrocarbon receptor isoform, 2nd AHR1 (2013)
  • Author(s): Lee, J. S., Iwabuchi, K., Nomaru, K., Nagahama, N., Kim, E. Y. and Iwata, H.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Presentation] Effects of aryl hydrocarbon receptor and transcriptional co-factor(s) on transactivation in MRL/lpr and C3H/lpr mouse strains (2013)
  • Author(s): Cho, S. W., Kim, E. Y., Suzuki, K., Miura, Y., Iwata, H., Miyazaki, T. and Nose, M.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Presentation] Isoform-specific responses of aryl hydrocarbon receptor to dioxins in red seabream (Pagrus major) (2013)
  • Author(s): Bak, S. M., Kim, E. Y., Iida, M. and Iwata, H.
  • Organizer: The XIII International Congress of Toxicology 2013
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 20130630-20130704
• [Remarks] 愛媛大学 沿岸環境科学研究センター 環境毒性学（岩田）研究室 日本語版
  • URL: http://ecotoxiwata.jp/
• [Remarks] 愛媛大学 沿岸環境科学研究センター 環境毒性学（岩田）研究室 英語版
  • URL: http://ecotoxiwata.jp/en/
• [Remarks] 愛媛大学「最先端研究紹介」
  • URL: http://www.ehime-u.ac.jp/research/infinity/detail.html?new_rec=9116