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2013 Fiscal Year Research-status Report

GMP reductaseを標的とした新規アフリカ睡眠病治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number 25660231
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Research InstitutionOsaka Prefecture University

Principal Investigator

乾 隆  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (80352912)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 石橋 宰  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (70293214)
西村 重徳  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (90244665)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords寄生虫 / 人獣共通感染症 / 酵素 / 薬剤反応性 / 獣医学 / 有機合成 / X線結晶構造解析
Research Abstract

本申請研究は,Trypanosoma brucei(T. brucei)由来GMP reductase(TbGMPR)を標的としたアフリカ睡眠病の新薬開発を目的とし,酵素反応速度論的解析,GMPR阻害剤であるribavirinとそのアナログの合成と薬効評価,TbGMPRおよびTbGMPR/ribavirinアナログ複合体のX線結晶構造解析を行い,アフリカ睡眠病に対するリード化合物を見出すことである。
平成25年度は,研究計画に従い,TbGMPRおよびウシ由来GMPR(BtGMPR)の反応速度論的解析(kcat,Kmの算出),それぞれのGMPRに対するribavirin 5'-monophosphate(RMP)のIC50値および阻害定数(Ki)を得た。
一方,RMPのアナログ化合物が新規抗Trypanosoma薬の開発につながると期待されるが,RMPを出発原料とするには高コストである。そこで本研究では安価で取り扱いやすいribavirinからRMPの有機化学合成を行い,収率55.4%,純度97.0%でRMPの合成に成功した。
さらに,構造を基にしたTbGMPR阻害剤の開発のために,TbGMPRの大量発現系の構築と結晶化を行った。TbGMPRのホモロジーモデリング等により,TbGMPRが有するcystathionine β-synthase (CBS) domainが結晶化の妨げになると予想し,CBS domain欠損変異体(ΔPhe97-Leu203)と(ΔPhe97-Arg226)を設計した。pET systemを用いた大腸菌発現系でこれらの変異酵素を発現し,各種クロマトグラフィーにより,約10 mg/Lの精製酵素を得る系を確立した。精製酵素から三次元結晶を得るために,市販の結晶化スクリーニング試薬を用いた結晶化条件の探索を行い,いくつかの結晶化条件で微結晶が得られた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「研究実績の概要」に記載のように,平成25年度は,1)酵素反応速度論的解析,2)医薬候補化合物の合成,および3)X線結晶構造解析に必要な各種酵素の大量精製系を確立を目指しており,1)~3)のすべての項目において良好な結果が得られている。
1)の酵素反応速度論的解析では,予定されたすべてのパラメータが決定された。さらに,宿主の1つであるヒト由来GMPR(HsGMPR1およびHsGMPR2)の組換え体の精製にも成功し,それらの酵素反応速度論的解析も行うとともに,RMPによる阻害効果がTbGMPRと比較して弱いことも確認できた。
2)の化合物の合成では,ribavirinを出発物質としたRMPの合成に成功した。これにより,安価でRMPアナログの合成が可能になると期待できる。また,合成したRMPの各種GMPRに対する阻害効果は,市販品RMPと同等であった。
3)のX線結晶構造解析に必要な各種酵素の大量精製系を確立は,CBS domain欠損変異体に関して,大腸菌培養液1 Lあたり10 mgの精製酵素を得ることができる計の確立に成功した。これまで,TbGMPRの収率は,< 0.5 mg/Lであったことを鑑みると20倍以上の大量精製系が構築できたといえる。
以上より,本申請研究は,概ね順調に進展していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度は,申請書の計画通りに本研究課題を推進する。
1)酵素の結晶化条件の検討,結晶構造解析,およびRibavirin類縁体の作製と薬効評価を行う。TbGMPR,BtGMPR,およびそれぞれの酵素にRMPが結合したRMP/酵素複合体の結晶構造を明らかにする。これまでに,2種類のヒト由来GMPRの結晶構造が報告されているので,これらの報告を参考にして,TbGMPR,およびBtGMPRの結晶化条件を検討する。結晶化条件の検討にはMolecular
Dimensions社の結晶化スクリーニングキットを用いる。結晶化に成功した場合,大型放射光施設SPring-8において,X線照射による結晶の回折データを回収し,ヒト由来GMPRをサーチモデルとした分子置換法によって位相を決定後,立体構造の精密化を行う。
2)RMP類縁体の作製と薬効評価では,昨年度合成に成功したRMPを出発物質とし,RMPアナログを合成し,化合物ライブラリーを構築する。一方,分子モデリングシミュレーションソフトAutoDockを用いて,TbGMPR,BtGMPR,あるいはHsGMPRの立体構造と化合物のドッキングモデルを作成する。分子動力学計算ソフトAMBERを用いて,ドッキングモデルにおけるTbGMPRと化合物,およびBtGMPRと化合物の結合自由エネルギーを計算し,TbGMPRに対して結合親和性が高く,BtGMPRやHsGMPRに対して弱い化合物を選定する。申請者らは,T. brucei培養系による化合物の抗トリパノソーマ活性評価法,およびT. brucei感染ラットを用いた化合物の薬効評価法をすでに確立しているおり,本評価法によりドッキングシミュレーションによって選定された化合物のin vitro,およびin vivoにおける薬効を検証する。

  • Research Products

    (14 results)

All 2014 2013

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (11 results) (of which Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Fine-tuned broad binding capability of human lipocalin-type prostaglandin D synthase for various small lipophilic ligands.2014

    • Author(s)
      Kume S, Lee YH, Nakatsuji M, Teraoka Y, Yamaguchi K, Goto Y, Inui T
    • Journal Title

      FEBS Lett

      Volume: 588 Pages: 962-969

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2014.02.001.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Characterization of the novel Trypanosoma brucei inosine 5'-monophosphate dehydrogenase2013

    • Author(s)
      Bessho T, Morii S, Kusumoto T, Shinohara T, Noda M, Uchiyama S, Shuto S, Nishimura S, Djikeng A, Duszenko M, Martin SK, Inui T, Kubata KB.
    • Journal Title

      Parasitology

      Volume: 140 Pages: 735-745

    • DOI

      10.1017/S0031182012002090

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 生体内輸送タンパク質を利用したドラッグデリバリーシステムの開発2013

    • Author(s)
      乾 隆
    • Journal Title

      化学と生物

      Volume: 51 Pages: 234-240

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 生体内輸送タンパク質を利用したドラッグデリバリーシステムの創成2014

    • Author(s)
      乾 隆
    • Organizer
      生物医工学サロン
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      20140122-20140122
    • Invited
  • [Presentation] Development of Drug Delivery System for Poorly Water-soluble Drugs Using Intravital Transporter protein2014

    • Author(s)
      Takashi Inui
    • Organizer
      Synchrotron Radiation in Nano-medicine and Advanced Health Care
    • Place of Presentation
      Konan University PortIsland Campus
    • Year and Date
      20140109-20140110
    • Invited
  • [Presentation] ヘム代謝産物誘導性神経細胞死に対するヒト由来リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の保護効果2013

    • Author(s)
      永島 真里子,藤森 功,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] アフリカトリパノソーマ症の薬剤標的候補であるグアノシン一リン酸還元酵素の酵素化学的機能解析2013

    • Author(s)
      木村千浩, 別所知明, 篠原貴宏, 石橋 宰, 乾 隆
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] マウス成熟破骨細胞の大規模トランスクリプトーム解析と遺伝子発現プロファイリング2013

    • Author(s)
      小谷 康人,今村 亮俊,今町 直登,鈴木 穣,秋光 信佳,乾 隆,石橋 宰
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] 生体内輸送タンパク質による難水溶性薬剤の可溶化とDDSへの応用2013

    • Author(s)
      乾 隆
    • Organizer
      BioJapan2013
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20131009-20131011
    • Invited
  • [Presentation] 腫瘍標的ペプチド付加リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いた難水溶性抗癌剤SN-38に対するドラッグデリバリーシステムの構築2013

    • Author(s)
      中辻匡俊,河野正樹,井上 遥,北出高志,斉藤茉有,柘植祥吾,佐野裕也,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] IgE結合能を低減した変異型Can f 1の作製と機能解析2013

    • Author(s)
      中山 駿,田畑瑞毅,櫻井光智子,福富友馬,石橋 宰,鎌田洋一,乾 隆
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] マウス歯根膜細胞におけるBMP2に対するendoglin依存的応答遺伝子の探索2013

    • Author(s)
      石橋 宰, 乾 隆
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素による難水溶性抗癌剤SN-38対するドラッグデリバリーシステム2013

    • Author(s)
      井上 遥,河野正樹,北出高志,斎藤茉有,中辻匡俊,中嶋秀満,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] 変異型リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素とジアゼパムの結合親和性と薬効の関係2013

    • Author(s)
      中辻匡俊,宮本優也,福原彩乃,久米慧嗣,西村重徳,吉田卓也,大久保忠恭,李 映昊,後藤祐児,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第13回蛋白質科学会
    • Place of Presentation
      とりぎん文化会館(鳥取)
    • Year and Date
      20130612-20130614

URL: 

Published: 2015-05-28  

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