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2014 Fiscal Year Research-status Report

GMP reductaseを標的とした新規アフリカ睡眠病治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number 25660231
Research InstitutionOsaka Prefecture University

Principal Investigator

乾 隆  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (80352912)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 石橋 宰  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (70293214)
西村 重徳  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (90244665)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords寄生虫 / 人獣共通感染症 / 酵素 / 薬剤反応性 / 獣医学 / 有機合成 / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements

本申請研究の目的は,Trypanosoma brucei(T. brucei)由来GMP reductase(TbGMPR)を標的としたアフリカ睡眠病の新薬開発を目的とし,酵素反応速度論的解析,GMPR阻害剤であるribavirinとそのアナログの合成と薬効評価,TbGMPRおよびTbGMPR/ribavirinアナログ複合体のX線結晶構造解析を行い,アフリカ睡眠病に対するリード化合物を見出すことである。
まず,立体構造を基にTbGMPR阻害剤を開発するために,X線結晶構造解析を行った。なお今年度は,結晶化の妨げになると予想されたcystathionine β-synthase domainを欠損させた変異体(ΔPhe97-Arg226)について結晶化条件の探索を行った。結晶化母液に0.1 M HEPES(pH 7.5),0.8 M リン酸一ナトリウム,0.8 M リン酸一カリウムを用い,温度 20℃におけるsitting drop蒸気拡散法により,構造解析に適した結晶を得ることに成功した。本結晶をSPring-8 BL38B1において,分解能2.36ÅでX線回折データを収集し構造計算を行ったところ,結晶学的 R-factor が 19.2%,およびfree R factor が 24.3%まで精密化することができ,TbGMPRΔPhe97-Arg226の立体構造を明らかにすることができた。
一方,宿主であるヒトGMPR(HsGMPR1およびHsGMPR2)の精製および反応速度論的解析を行い,T. brucei型とヒト型との酵素化学的諸性質の比較を行った。その結果,T. brucei型とヒト型では基質や補酵素に対する親和性が異なることが明らかとなり, 両者の活性中心の構造が異なることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「研究実績の概要」に記載のように,平成26年度は予定どおりTbGMPRのX線結晶構造解析および酵素反応速度論的解析を中心に行った。
TbGMPRの構造解析においては,cystathionine β-synthase domainを欠損させた変異体ΔPhe97-Arg226の立体構造解析を試み,X線結晶構造解析に適した結晶を再現性良く作製する方法を確立するとともに,当初の計画通り,TbGMPR阻害剤を開発するために必要なTbGMPRの立体構造を分解能2.36Åで明らかにすることができた。
一方,宿主であるヒトGMPR(HsGMPR1およびHsGMPR2)の精製および反応速度論的解析を行い,TbGMPRとHsGMPR1およびHsGMPR2では基質や補酵素に対する親和性が異なることを明らかにし,活性中心の構造が異なることを示すことができた。T. brucei型とヒト型におけるこれらの違いは,TbGMPR選択的阻害剤を設計する上で大きなアドバンテージとなる。
また,GMPR阻害剤であるribavirinを出発物質としたribavirin 5'-monophosphate(RMP)の合成では,その収率が55%から60%へ上がり,より安価でRMPアナログの合成が可能となった。さらに,より強い抗原虫作用を示すribavirin誘導体のスクリーニング系を構築することを視野に,血流型T. bruceiの培養系を構築し,ribavirinに対するIC50値を求めた結果,ribavirinはT. brucei brucei,およびT. brucei gambienseに対しても増殖を抑制することが判明し,IC50値は1~10 μM 程度であった。
以上より,本申請研究は,概ね順調に進展していると判断できる。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は,申請書の計画通りに本研究課題を推進する。
昨年度までの研究成果により,TbGMPRΔPhe97-Arg226のアポ状態における立体構造を明らかにした。本年度は引き続き,TbGMPRに対して基質であるGMP,あるいはNADPHが結合した酵素基質複合体,あるいはリバビリンやリバビリンアナログなどの阻害剤が結合した酵素阻害剤複合体の立体構造の解明を目指す。酵素基質複合体の構造を観察するために,触媒残基であるCys318をAlaに置換し,触媒活性を欠失させたTbGMPRを作製し,構造解析に利用する。アポ状態,および複合体中でのTbGMPRの立体構造情報を用いて,分子モデリングシミュレーションソフトAutoDockなどを利用し,化合物ライブラリーに対するin silicoスクリーニングを行う。
また,ヒト由来HsGMPRやウシ由来BtGMPRなど他の宿主由来GMPRについても同様のスクリーニングを行い,TbGMPRに特異的な化合物を探索する。そこで得られた化合物情報に基づき,ribavirin,あるいはRMPを出発物質としたTbGMPR阻害剤(RMPアナログ)の合成を試みる。
さらに,合成されたRMPアナログについて,in vitro,およびin vivoにおける薬効を検証する。申請者らはすでに,抗原虫活性を評価するための,in vitroにおけるT. brucei培養評価系,およびin vivoにおけるT. brucei感染ラットを用いた化合物の薬効評価系を確立しており,設備などにも問題はない。

  • Research Products

    (30 results)

All 2015 2014 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (26 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] A toxin isolated from Sarcocystis fayeri in raw horsemeat may be responsible for food poisoning.2014

    • Author(s)
      Kamata, Y., Saito, M., Irikura, D., Yahata, Y., Ohnishi, T., Bessho, T., Inui, T., Watanabe, M., and Sugita-Konishi, Y.
    • Journal Title

      J. Food Prot.

      Volume: 77 Pages: 814-819

    • DOI

      10.4315/0362-028X.JFP-13-351

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of endoglin-dependent BMP-2-induced genes in the murine periodontal ligament cell line PDL-L2.2014

    • Author(s)
      Ishibashi O., Inui T.
    • Journal Title

      J. Mol. Signal.

      Volume: 9 Pages: 5

    • DOI

      10.1186/1750-2187-9-5

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Lipocalin-type prostaglandin D synthase scavenges biliverdin in the cerebrospinal fluid of patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhage.2014

    • Author(s)
      Inui T., Mase M., Shirota R., Nagashima M., Okada T., Urade Y.
    • Journal Title

      J. Cereb. Blood. Flow. Metab.

      Volume: 34 Pages: 1558-1567

    • DOI

      10.1038/jcbfm.2014.127

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 網羅的トランスクリプトーム解析による破骨細胞選択的高発現を示す遺伝子の探索2015

    • Author(s)
      石橋 宰,小谷 康斗,今村 亮俊,今町 直登,鈴木 譲,秋光 信佳,目良 恒, 吉矢 晋一,乾 隆
    • Organizer
      日本農芸化学会2015年度大会
    • Place of Presentation
      岡山大学
    • Year and Date
      2015-03-26 – 2015-03-29
  • [Presentation] Paenibacillus polymyxa由来β-アミラーゼとマルトースおよびマルトペンタオースとの複合体のX線結晶構造解析2015

    • Author(s)
      肥垣津 雄日,多田 俊治,炭谷 順一,川口 剛司,乾 隆,西村 重徳
    • Organizer
      日本農芸化学会2015年度大会
    • Place of Presentation
      岡山大学
    • Year and Date
      2015-03-26 – 2015-03-29
  • [Presentation] Lipocalin-type prostaglandin D合成酵素によるくも膜下出血後髄液中heme代謝産物不活化排泄機構2015

    • Author(s)
      間瀬 光人,乾 隆,城田 涼子,永島 真理子,岡田 哲也,山田 和雄,裏出 良博
    • Organizer
      第31回 スパズム・シンポジウム
    • Place of Presentation
      リーがロイヤルホテル広島
    • Year and Date
      2015-03-26 – 2015-03-29
  • [Presentation] 生体内輸送タンパク質による難水溶性薬剤の可溶化技術とDDSへの応用2015

    • Author(s)
      乾 隆
    • Organizer
      DSANJ疾患別商談会(創薬基盤技術)
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-29 – 2015-01-29
    • Invited
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いた難水溶性抗癌剤SN-38に対するドラッグデリバリーシステム2015

    • Author(s)
      中辻 匡俊,井上 遥,河野 正樹,齋藤 茉有,柘植 祥吾,清水 翔太,佐野 裕也,石田 敦子,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      Bio Medical Forum 2015
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-23 – 2015-01-23
  • [Presentation] Brevibacillus choshinensisを用いたリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の発現系の構築2015

    • Author(s)
      柘植 祥吾,中辻 匡俊,河野 正樹,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      Bio Medical Forum 2015
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-23 – 2015-01-23
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いたドラッグデリバリーシステムに適応可能な難水溶性薬剤の網羅的探索2015

    • Author(s)
      寺岡 佳晃,久米 慧嗣,乾 隆
    • Organizer
      Bio Medical Forum 2015
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-23 – 2015-01-23
  • [Presentation] アフリカトリパノソーマ症の病原性原虫および宿主におけるグアノシン一リン酸還元酵素の機能解析2015

    • Author(s)
      今村 章,別所 知明,篠原 貴宏,木村 千浩,岡田 哲也,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      Bio Medical Forum 2015
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-23 – 2015-01-23
  • [Presentation] 初代培養ラット腎糸球体ポドサイトの網羅的トランスクリプトーム解析2015

    • Author(s)
      堀川 彩,矢尾板 永信,小谷 康斗,尾形 善之,山口 勝司,重信 秀治,乾 隆, 石橋 宰
    • Organizer
      Bio Medical Forum 2015
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2015-01-23 – 2015-01-23
  • [Presentation] 癌指向性を有する難水溶性抗癌剤内包タンパク質ナノカプセルの開発とDDSへの 応用2014

    • Author(s)
      乾 隆
    • Organizer
      第3回 BNCTなかもずセミナー
    • Place of Presentation
      大阪府立大学
    • Year and Date
      2014-10-30 – 2014-10-30
    • Invited
  • [Presentation] 担癌マウスにおける腫瘍標的ペプチド付加リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の生体内分布2014

    • Author(s)
      北出 高志,中辻 匡俊,河野 正樹,井上 遥,久米 慧嗣,田村 泰久,片岡 洋祐,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 難水溶性抗癌剤SN-38内包リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素投与後におけるSN-38の組織分布および副作用の評価2014

    • Author(s)
      齋藤 茉有,中辻 匡俊,柘植 祥吾,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の難水溶性抗癌剤SN-38に対する新規薬剤キャリアとしての有用性2014

    • Author(s)
      中辻 匡俊,井上 遥,河野 正樹,齋藤 茉有,柘植 祥吾,佐野 裕也,清水 翔太,石田 敦子,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] Brevibacillus choshinensisを用いたリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の発現系の構築2014

    • Author(s)
      柘植 祥吾,中辻 匡俊,河野 正樹,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いたドラッグデリバリーシステムに利用可能な難水溶性薬剤の探索法の構築2014

    • Author(s)
      寺岡 佳晃,久米 慧嗣,中辻 匡俊,山口 桂右,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] アフリカトリパノソーマ症の原虫および宿主におけるグアノシン一リン酸還元酵素の機能解析2014

    • Author(s)
      木村 千浩,別所 知明,篠原 貴宏,岡田 哲也,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] IgE結合能を低減した変異型Can f 1の機能解析2014

    • Author(s)
      櫻井 光智子,中山 駿,福富 友馬,石橋 宰,鎌田 洋一,乾 隆
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 初代培養ラットポドサイトにおけるエンドセリン応答性遺伝子・マイクロRNAのトランスクリプトミクスによる探索2014

    • Author(s)
      堀川 彩,矢尾板 永信,小谷 康斗,尾形 善之,山口 勝司,重信 秀治,乾 隆, 石橋 宰
    • Organizer
      第87回 日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] Drug delivery system for poorly water-soluble anti-tumor drug SN-38 utilizing L-PGDS.2014

    • Author(s)
      中辻 匡俊,井上 遥,河野 正樹,齋藤 茉有,柘植 祥吾,清水 翔太,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      The 5th International Conference on Nanotechnology: Fundamentals and Applications
    • Place of Presentation
      チェコ/プラハ
    • Year and Date
      2014-08-11 – 2014-08-13
  • [Presentation] Improvement of solubility of poorly water-soluble drugs using lipocalin-type prostaglandin D synthase.2014

    • Author(s)
      寺岡 佳晃,久米 慧嗣,中辻 匡俊,山口 桂右,乾 隆
    • Organizer
      The 5th International Conference on Nanotechnology: Fundamentals and Applications
    • Place of Presentation
      チェコ/プラハ
    • Year and Date
      2014-08-11 – 2014-08-13
  • [Presentation] リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いた難水溶性抗癌剤SN-38に対するドラッグデリバリーシステム2014

    • Author(s)
      中辻 匡俊,井上 遥,河野 正樹,齋藤 茉有,柘植 祥吾,佐野 裕也,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第30回 日本DDS学会学術集会
    • Place of Presentation
      慶応大学薬学部
    • Year and Date
      2014-07-30 – 2014-07-31
  • [Presentation] 大規模トランスクリプトミクスによるマウス成熟破骨細胞の遺伝子発現プロファイリング2014

    • Author(s)
      小谷 康斗,乾 隆,石橋 宰
    • Organizer
      第32回 日本骨代謝学会学術集会
    • Place of Presentation
      大阪国際会議場
    • Year and Date
      2014-07-24 – 2014-07-26
  • [Presentation] Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase aggregates acts as a seed of amyloid-β40 amyloidogenesis and enhances the cell death both in vitro and in vivo.2014

    • Author(s)
      Nakajima H., Kubo T., Itakura M., Kaneshige A., Fukuhara A., Azuma Y., Inui T., Takeuchi T.
    • Organizer
      26th International Conference of Alzheimer's Association International Conference
    • Place of Presentation
      デンマーク/コペンハーゲン
    • Year and Date
      2014-07-12 – 2014-07-17
  • [Presentation] 腫瘍標的ペプチド付加リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を用いた難水溶性抗癌剤SN-38に対するドラッグデリバリーシステム2014

    • Author(s)
      中辻 匡俊,河野 正樹,井上 遥,清水 翔太,石橋 宰,乾 隆
    • Organizer
      第14回 日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [Presentation] ヒト由来リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素と脂溶性低分子との結合反応における熱力学的調節機構2014

    • Author(s)
      寺岡 佳晃,久米 慧嗣,李 映昊,中辻 匡俊,山口 桂右,後藤 祐児,乾 隆
    • Organizer
      第14回 日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [Presentation] pH依存的なヒトリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の熱安定性に関する 研究2014

    • Author(s)
      飯田 津喜美,李 映昊,中辻 匡俊,寺岡 佳晃,久米 慧嗣,後藤 祐児,乾 隆
    • Organizer
      第14回 日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [Remarks] 大阪府立大学 大学院生命環境科学研究科 応用生命科学専攻 生体高分子機能学研究室

    • URL

      http://www.bioinfo.osakafu-u.ac.jp/~inuit/

URL: 

Published: 2016-05-27  

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