• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2013 Fiscal Year Research-status Report

自然界に存在しない物質に対する栄養要求性による新規生物学的封じ込め技術の開発

Research Project

Project/Area Number 25660281
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Research InstitutionNational Institute of Agrobiological Sciences

Principal Investigator

加藤 祐輔  独立行政法人農業生物資源研究所, 昆虫機能研究開発ユニット, 上級研究員 (60214409)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords生物学的封じ込め / 遺伝子組換え生物 / 翻訳調節 / 非天然アミノ酸 / 合成生物学
Research Abstract

(1)非天然アミノ酸依存性翻訳スイッチによる遺伝子発現の調節: 非天然アミノ酸依存性翻訳スイッチは、非天然アミノ酸を必須栄養素として要求する大腸菌を作出するための鍵技術である。非天然アミノ酸が存在しないとき、発現量がほぼゼロになることが重要となる。アンバー終止コドンに非天然アミノ酸3-ヨウ化-L-チロシン(IY)を導入するアミノアシルtRNAシンテターゼ/tRNA系では、IYが存在しなくても約7%の漏洩翻訳が認められた。これは、シンテターゼまたはtRNAの発現抑制との併用、標的遺伝子に挿入するアンバー終止コドンの多重化、およびシンテターゼのプロモーターの適切な選択により、<1%に抑制できた。さらに、標的遺伝子の転写調節との二重制御により、漏洩発現をほぼ完全にゼロに抑制することに成功した。成果は論文として公表した。
(2)生存に必須な遺伝子の発現が非天然アミノ酸依存する大腸菌の作出: 全ゲノム配列が公表されている実験用大腸菌DH10Bに、アンバー終止コドンにIYを導入するアミノアシルtRNAシンテターゼ/tRNA発現プラスミドを形質転換しようとしたが、目的の形質転換体は得られなかった。DH10Bは、アンバー終止コドンの抑制に対して致死であると推測された。そこで、全ゲノム配列が明らかな他の系統として、大腸菌BL21(DE3)を選択し、上記のシンテターゼ/tRNA発現プラスミドの導入に成功した。3-ヨウ化-L-チロシン存在下でアンバー終止コドンを翻訳する条件下で、必須遺伝子のひとつlpxCをアンバー終止コドンを挿入した変異遺伝子と置換した系統を作出した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

翻訳スイッチによって、非天然アミノ酸存在時には十分な発現があり、かつ存在しない時には完全に発現をゼロに抑えることができた。これは、非天然アミノ酸を必須栄養素とする大腸菌系統を作出するのに、この翻訳スイッチは十分な性能をもつことを裏付ける結果である。また、大腸菌の生存に必須な遺伝子のひとつlpxCを、翻訳スイッチの制御下に置くために、アンバー終止コドンを挿入した変異遺伝子置換系統の作出にも成功した。

Strategy for Future Research Activity

現在進行中のlpxCアンバー終止コドン挿入系統の評価を進める。また、非天然アミノ酸存在下でのみ発現する抗毒素による、能動的封じ込めについても、研究に着手する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

PCRプライマーとして用いるオリゴDNAの合成費用に、見積もりとの若干の差額が生じた。実験結果に影響される避けられない誤差である。
次年度の同費目として繰り入れて、上記の理由による誤差の緩衝とする。

  • Research Products

    (4 results)

All 2014 2013

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] High-yield, zero-leakage expression system with a translational switch using site-specific unnatural amino acid incorporation.2014

    • Author(s)
      Masaomi Minaba, Yusuke Kato
    • Journal Title

      Applied and Environmental Microbiology

      Volume: 80 Pages: 1718-1725

    • DOI

      10.1128/AEM.03417-13

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 部位特異的非天然アミノ酸導入を利用した翻訳スイッチの性能に影響する因子2014

    • Author(s)
      加藤祐輔、皆葉正臣
    • Organizer
      日本農芸化学会2014年度大会
    • Place of Presentation
      神奈川県川崎市
    • Year and Date
      20140327-20140330
  • [Presentation] 部位特異的非天然アミノ酸導入を利用した翻訳スイッチと高収量無漏洩発現系への応用2013

    • Author(s)
      皆葉正臣, 加藤祐輔
    • Organizer
      「細胞を創る」研究会 6.0
    • Place of Presentation
      山形県鶴岡市
    • Year and Date
      20131114-20131115
  • [Presentation] Translational switch by site-specific unnatural amino acid incorporation2013

    • Author(s)
      Minaba M, Kato Y
    • Organizer
      The 65th Fujihara Seminar: International Symposium on Synthetic Biology of Unnatural Base Pairs and Amino Acids
    • Place of Presentation
      北海道苫小牧市
    • Year and Date
      20131001-20131004

URL: 

Published: 2015-05-28  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi