核局在性非コードRNAの高効率ノックダウンに向けたAgo2の核移行メカニズム解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670013
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 櫻井 文教 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (70370939)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: Argonaute 2 / 核移行 / 細胞内動態 / RNA干渉

Outline of Annual Research Achievements

Argonaute 2 (Ago2)は、RNA-induced silencing complex (RISC)の主要構成成分であり、Post-transcriptional Gene Silencingを担う最も重要な因子である。これまでにAgo2が細胞質のみならず核にも局在することが報告されているが、Ago2の核移行メカニズムは明らかとなっていない。そこで、Ago2の核移行メカニズムの解明を試みた。まずAgo2のアミノ酸配列から核移行シグナルとして予想される配列を、in silico解析により同定し、その部位にアミノ酸変異を導入し核移行を検討したが、Ago2の細胞内局在に大きな違いは観察されなかった。次にAgo2の各機能ドメインにアミノ酸変異を導入し、その変異体の核移行について検討したところ、ある変異体においてAgo2の核移行が大きく抑制された。その核移行が抑制された変異体では、あるタンパク質の結合に重要な領域にアミノ酸置換が導入されていた。さらにそのタンパク質には核移行シグナルが存在していることから、Ago2はそのタンパク質とともに核に移行していることが予想された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Ago2の核移行を担うタンパク質の同定に成功しており、またAgo2内の核移行に重要なドメインの同定も終了している。現在、最終的な再現性の確認とAgo2と核移行を担うタンパク質の結合を免疫沈降により検討している。

Strategy for Future Research Activity

現在、Ago2とAgo2の核移行を担うタンパク質の細胞内における結合を免疫沈降により検討している。また、これまで得られたデータの最終的な再現性を確認しており、それが終了次第、論文投稿する予定である。

Causes of Carryover

一部、予想とは異なる実験結果が得られたため、追加実験を行う必要が生じた。また結論を得るために実施しなければならない実験が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

実験試薬の購入に使用する予定である。